Mẫu C1 (µg/mL) C2 (µg/mL) C3 (µg/mL) C4 (µg/mL) C5 (µg/mL)
H, M, D 5 10 20 40 50
Taxol 0,003 0,03 0,3 3 30
Chuẩn bị tế bào: Với mỗi dòng tế bào, chuẩn bị dung dịch tế bào sao cho có 5.000TB/180 µL/giếng trên đĩa 96 giếng. Trộn nhẹ để tế bào phân tán đều trong các giếng, quan sát kiểm tra dƣới KHV đảo chiều, ủ ở 37o
C, 5% CO2 trong 24h để tế bào ổn định và bám vào bề mặt đĩa.
Chuẩn bị dung dịch thuốc trung gian và ủ chất: Pha dung dịch trung gian tƣơng ứng có nồng độ cao gấp 10 lần nồng độ cuối cần thử trong giếng. Bổ sung 20 µL dung dịch trung gian tƣơng ứng rồi lắc nhẹ để thuốc phân bố đều trong giếng, ủ 48h ở 37oC, 5% CO2, quan sát và ghi lại hình ảnh hàng ngày.
Ủ MTS và đo mật độ quang học: Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 1PMS:20 MTS. Thêm 30 µL hỗn hợp trên vào mỗi giếng đang chứa 200 µL dung dịch mơi trƣờng ni cấy đã đƣợc bổ sung thuốc và ủ với tế bào trong 48h. Ủ hỗn hợp trên trong 3h ở điều kiện 37oC, 5% CO2 rồi tiến hành đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 490nm. Dùng phần mềm Excel để xử lý số liệu, tính chỉ số IC50 – Là giá trị nồng độ chất thử tại đó chất thử có khả năng gây chết 50% tế bào.
Chỉ số IC50 của một chất với một dòng tế bào đƣợc tính từ nghiệm phƣơng trình hồi quy biểu diễn tƣơng quan giữa x là nồng độ hoặc log nồng độ chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A (%) của dịng tế bào đó khi đƣợc ủ với chất thử ở các nồng độ khác nhau, khi y = 50 (%).
A (%) đƣợc tính theo cơng thức: o A (%) = V/Vh x 100%
V: Chỉ số OD đo đƣợc ở trong giếng thí nghiệm
2.6. Phƣơng pháp thử độc tính trên mơ hình spheroid
Tạo giá thể cho khối spheroid bằng agarose 1,5% cho vào các giếng của đĩa 96. Chờ agarose đông lại tiến hành tạo giọt treo trên nắp đĩa 96 với mật độ 5.000TB/giọt treo.
Sau 2 ngày tạo giọt treo, khi quan sát thấy các tế bào dƣới tác dụng của trọng lực đã tạo thành cụm, tiến hành hạ giọt treo vào các giếng tƣơng ứng đã có giá thể agarose 1,5% và mơi trƣờng ni cấy phù hợp.
Với thí nghiệm theo dõi tốc độ sinh trƣởng của khối spheroid
Theo dõi hàng ngày và thay môi trƣờng, chụp ảnh 2 ngày/lần cho đến khi khối spheroid phân rã.
Đo kích thƣớc khối spheroid và tính thể tích khối bằng phần mềm AxioVison L.E. R4.5, dựng đƣờng cong sinh trƣởng để biết quy luật tăng trƣởng của khối spheroid.
Với thí nghiệm kiểm tra tác động của H lên khả năng tạo khối spheroid
Sau khi tạo giá thể, tiến hành tạo giọt treo trên nắp đĩa 96 giếng với mật độ 5,000TB/giọt treo theo các nhóm mẫu thí nghiệm tƣơng ứng bằng mơi trƣờng có chứa H nồng độ (NĐ) 5µg/mL và mơi trƣờng có chứa H NĐ 10µg/mL.
Sau 2 ngày, tiến hành hạ giọt treo xuống các giếng chứa môi trƣờng hoặc môi trƣờng chứa H với nồng độ tƣơng ứng.
Theo dõi hàng ngày và thay môi trƣờng, chụp ảnh 2 ngày/lần
Đo kích thƣớc khối spheroid và tính thể tích khối bằng phần mềm AxioVison L.E. R4.5, dựng đƣờng cong sinh trƣởng của khối spheroid ở ba mẫu khác nhau và so sánh sự khác biệt xem liệu H có ảnh hƣởng đến q trình tạo khối spheroid hay khơng.
Với thí nghiệm theo dõi tác động của H lên quá trình tăng trƣởng khối spheroid
Sau khi tạo giá thể, tạo giọt treo và hạ giọt treo vào các giếng tƣơng ứng đã có giá thể agarose 1,5% và môi trƣờng nuôi cấy thƣờng, các khối spheroid hình thành đƣợc nuôi trong môi trƣờng 37o
C, 5% CO2.
Sau 5 ngày hạ giọt treo, tiến hành chia các giếng có chứa các khối spheroid đồng đều, phát triển khỏe mạnh thành ba nhóm mẫu: Đối chứng sinh học (ĐCSH), mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, và mẫu ủ H NĐ 20µg/mL. Theo dõi hàng ngày, thay môi trƣờng tƣơng ứng và chụp ảnh 2 ngày/lần Đo kích thƣớc khối spheroid và tính thể tích khối bằng phần mềm
AxioVison L.E. R4.5, dựng đƣờng cong sinh trƣởng của khối spheroid, so sánh sự khác biệt xem H có tác động lên quá trình sinh trƣởng của khối spheroid hay không.
2.7. Phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang
Nồng độ thuốc thử:
H: 10 µg/mL và 20 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên actin) H, M, D: 10 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên Aurora kinaza) Taxol: 0,3 µg/mL
Quy trình thí nghiệm
Chuẩn bị 4 đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm, mỗi đĩa chứa 04 coverglass. Bổ sung vào mỗi đĩa dung dịch chứa TBUT Hela nuôi với mật độ 500.000TB/2,25mL môi trƣờng. Các đĩa đƣợc chia thành 4 mẫu thí nghiệm tƣơng ứng gồm: ĐCSH, H NĐ 10µg/mL, H NĐ 20µg/mL và Taxol 0,3µg/mL
Sau 24h ni cấy cho tế bào ổn định, bám xuống bề mặt coverglass, tiến hành ủ thuốc với các nồng độ đã dự kiến.
Cố định mẫu khi thấy phần lớn các tế bào đã có biến đổi hình thái rõ rệt dƣới tác động của chất thử và vẫn đang bám ở trên đĩa.
Nhuộm mẫu theo các bƣớc nhƣ sau:
o Cố định mẫu bằng PFA 4% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
o Đục màng tế bào bằng TrytonX 0,5% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. o Block các liên kết không đặc hiệu và bộc lộ các liên kết đặc hiệu bằng
cách ủ mẫu với BSA 5% ở nhiệt độ phịng trong 30 phút. - Với thí nghiệm kiểm tra tác động lên vi sợi actin:
o Nhuộm kháng thể 1 anti alpha-tubulin trong 1h ở nhiệt độ phịng, tránh sáng. Sau đó nhuộm kháng thể 2 M488 trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Nhuộm trực tiếp actin bằng Red-phalloidine trong 1h ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Nhuộm nhân bằng Hoechst 3334 trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Quan sát dƣới KHV huỳnh quang và ghi lại hình ảnh phân tích. - Với thí nghiệm kiểm tra tác động lên sự phosphoryl hóa Histone H3:
o Nhuộm kháng thể 1 anti histone H3 antibody trong 1h ở nhiệt độ phịng, tránh sáng. Sau đó, nhuộm kháng thể 2 M488 trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Nhuộm nhân bằng Hoechst 3334 trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát đô ̣c tính của Honokiol , Magnolol và Derrone trê n mơ
hình 2D
3.1.1. Với dịng HCT116
Sau 48h ủ với các chất thí nghiệm, tiến hành chụp ảnh mẫu dƣới KHV đảo chiều, thu đƣợc kết quả nhƣ sau: các tế bào HCT116 có kích thƣớc nhỏ, hình dạng dài.
Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x)
Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL (phải) (100x)
Khơng có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu ĐCDM ủ DMSO 0,125% với mẫu ĐCSH. Sau 48h ủ, ngay ở nồng độ thứ nhất (5µg/mL) H đã có tác dụng rõ rệt: 80% các tế bào co trịn lại. Ở nồng độ thứ hai (10µg/mL) các tế bào chỉ còn là các chấm
tròn nhỏ và khơng cịn sự khác biệt rõ rệt về hình thái với 3 nồng độ 20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL cịn lại.
Magnolol (M) tác động rõ rệt đến tế bào HCT116 theo xu hƣớng tƣơng tự ngay từ nồng độ 5µg/mL và cũng khơng có sự khác biệt rõ rệt về hình thái ở 4 nồng độ 10 µg/mL, 20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL cịn lại.
Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL (phải) (100x)
Với Taxol, sau 48h ủ, ở nồng độ thứ nhất 0,003µg/mL tế bào đã có xu hƣớng co lại so với mẫu ĐCSH. Xu hƣớng này tăng rõ rệt theo chiều tăng nồng độ, các tế bào co lại thành dạng tròn và nhỏ dần từ nồng độ 0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL đến 30µg/mL.
Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x)
Sau khi thực hiện phản ứng kiểm tra độc tính của chất bằng phƣơng pháp MTS, đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 490nm, chúng tôi sử dụng phần mềm
Excel để xử lý số liệu đo OD thu đƣợc. Kết quả tính chỉ số tăng sinh A (%) với dòng HCT116 đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol và Taxol Chất C (µg/mL) Lg(C) A(%) Honokiol 5,00 0,7 30,03 10,00 1,00 17,25 20,00 1,30 17,54 40,00 1,60 18,97 50,00 1,7 20,47 Magnolol 5,00 0,7 18,88 10,00 1,00 16,99 20,00 1,30 17,16 40,00 1,60 18,27 50,00 1,7 19,64 Taxol 0,003 -2,52 74,79 0,03 -1,52 72,52 0,30 -0,52 63,79 3,00 0,48 19,18 30,00 1,48 18,37
Sử dụng phầm mềm Excel, tiến hành vẽ đồ thị biểu diễn đƣờng cong đáp ứng liều của dòng TBUT HCT116 với các chất H, M và Taxol dựa trên bảng số liệu A(%) chúng tôi thu đƣợc các đồ thị nhƣ sau:
Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H)
Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Taxol
Dựa trên kết quả chỉ số tăng sinh A (%) và các đồ thị trên, có thể thấy các chỉ số OD tƣơng đồng với kết quả quan sát hình ảnh sơ bộ trên KHV đảo chiều. Với H, chỉ số A(%) giảm xuống còn 30% ở nồng độ thứ nhất 5µg/mL và khơng có sự khác biệt rõ rệt về chỉ số A(%) ở các nồng độ còn lại (17; 17; 18 và 20%). Điều này có thể giải thích là do các tế bào đã bị ức chế tối đa ngay từ nồng độ thứ hai. Tƣơng tự với M, ngay ở nồng độ thứ nhất 5µg/mL tế bào cũng đã bị ức chế tối đa và khơng có sự khác biệt rõ rệt về chỉ số A(%) giữa năm nồng độ này. Với Taxol, chỉ số A (%) giảm dần theo chiều tăng nồng độ và bắt đầu giảm mạnh từ nồng độ thứ ba 0,3µg/mL (63,8%) xuống nồng độ thứ tƣ 3µg/mL (19%). Khơng có sự khác biệt rõ rệt giữa nồng độ thứ tƣ 3µg/mL và nồng độ thứ năm 30µg/mL do đến nồng độ thứ tƣ các tế bào HCT116 đã bị ức chế tối đa.
Dựa vào mô hình tƣơng quan hồi quy xây dựng đƣợc dựa trên mỗi đồ thị bằng chƣơng trình Excel, chúng tôi thu đƣợc giá trị IC50 tƣơng ứng với H, M và Taxol tƣơng ứng nhƣ sau: