Aurora kinaza thuộc nhóm những protein điều khiển quá trình phân bào. Chúng bao gồm ba protein thành viên có tên gọi Aurora A, Aurora B và Aurora C. Các protein này liên quan đến quá trình hình thành và phân chia trung thể, quá trình liên kết các kinetochore với các vi sợi (microtubule) và sự sắp xếp của thoi vơ sắc. Vì vậy, những protein này đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phân chia
của nhiễm sắc thể và sự ổn định về nhân tế bào [41]. Sự quan tâm đến các protein này tăng lên khi các nhà khoa học nhận thấy sự tƣơng quan giữa sự biểu hiện quá mức của các protein này trong rất nhiều loại ung thƣ với sự bất thƣờng của bộ nhiễm sắc thể [2]. Gen quy định Aurora A nằm trên nhiễm sắc thể 20 của ngƣời tại vị trí 20q13. Sự biểu hiện quá mức của protein này lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở ung thƣ ruột nguyên phát. Đây chính là bằng chứng đầu tiên cho thấy mối liên quan giữa Aurora và ung thƣ. Aurora hoạt động nhƣ gen gây ung thƣ khi chuyển nhiễm vào các dòng tế bào nguyên bào sợi Rat1 ở chuột cống hay NIH3T3 ở chuột nhắt. Gen Arora A khơng những đƣợc tăng cƣờng trong nhiều dịng tế bào mà còn ở 52% ung thƣ trực tràng nguyên phát và 12% ung thƣ phổi nguyên phát [13].
Aurora B cũng biểu hiện quá mức ở các dòng tế bào tách từ ung thƣ ruột [9]. Hơn nữa, sự biểu hiện quá ngƣỡng của Aurora B trong tế bào ni cấy kích thích sự phân chia nhiễm sắc thể một cách bất thƣờng. Những tế bào hình thành sẽ là những tế bào nhân quái (aneuploidy) và có thể thúc đẩy sự hình thành ung thƣ ở chuột [31]. Tại kỳ giữa và kỳ sau của quá trình phân bào, Aurora B tạo thành phức hợp với các protein khách (passenger proteins) nhƣ Survivin, INCENP, TD60 và Borealin. Những protein này cũng biểu hiện vƣợt mức ở một số loại ung thƣ nhƣ ung thƣ trực tràng, ung thƣ ruột, ung thƣ vú… và một số dòng tế bào chuyển dạng. Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng Survivin và INCENP là cơ chất cho hoạt tính enzym của Aurora B đồng thời chúng cũng là tác nhân kích thích hoạt tính của protein này [37]. Nhƣ vậy, trong các dịng tế bào ung thƣ, hoạt tính của Aurora B phụ thuộc vào sự biểu hiện của chính bản thân nó và các protein liên quan.
Aurora C biểu hiện quá mức ở ung thƣ tuyến tiền liệt và một số dịng tế bào ung thƣ khác [41]. Điều đó chứng tỏ rằng nó có thể có vai trị trong ung thƣ tế bào soma. Mặc dù vậy, sự hiểu biết về chức năng của protein này vần còn rất nghèo nàn. Những điều trên chứng tỏ Aurora kinaza là một mục tiêu trong điều trị ung thƣ và do vậy việc tìm kiếm các chất ức chế hoạt tính của Aurora kinaza là rất cần thiết. Một vài chất ức chế đã đƣợc nghiên cứu và công bố nhƣ ZM447469 (2003),
Hesperadin (2004), VX-680 (2004) and PHA-680632 (2006), Benzo[e]pyridoindole
(2008) (Hình 13). Trong số đó, VX680 có tác dụng ức chế sự phát triển ung thƣ in
vivo và hiện nay đang đƣợc xem xét để thử nghiệm lâm sàng. Tuy nhiên những chất
ức chế này có một số tác dụng phụ và tính đặc hiệu chƣa cao. VX680 là một chất có nhiều triển vọng nhất hiện nay trong việc ức chế hoạt tính của Aurora, nhƣng đồng thời nó cũng ức chế FLT-3, LcK và kinaza đột biến BcrAbl T315I. Mặt khác, hoạt tính của chất này còn phụ thuộc vào p53. Hơn nữa, trong quá trình phát triển u thƣờng xuất hiện các đột biến xung quanh các vị trí (sites) điều khiển hoạt tính kinaza. Do vậy, việc nghiên cứu và tìm kiếm các chất ức chế đặc hiệu hơn là rất cần thiết [16].
Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza
CHƢƠNG 2 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Các dòng TBUT HCT116, Hela, MCF7 và KPL4 do Nhóm nghiên cứu Ung thƣ thực nghiệm – Bộ môn Tế bào, Mô, Phôi và Lý sinh – Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.
- Mẫu Honokiol (H), Magnolol (M) và Derrone (D) do Viện Dƣợc liệu Trung ƣơng cung cấp, dạng dung dịch đồng nhất lƣu trữ ở nồng độ 20.000µg/mL trong dung mơi DMSO.
- Đối chứng dƣơng Taxol, dạng thƣơng phẩm 30mg/5mL, tƣơng đƣơng 6.000µg/mL.
2.2. Máy móc, dụng cụ
Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao
Tên Hãng sản xuất
Buồng đếm tế bào Thomas, Đức
Coverglass Trung Quốc
Đĩa 96 giếng Corning, Mỹ
Đĩa nuôi cấy tế bào 35, 100mm Corning, Mỹ
Lame, lamelle Trung Quốc
Ống Falcon 15, 50mL Corning, Mỹ
Pipet nhựa 1mL, 2mL, 5mL, 10mL Corning, Mỹ
Tube bảo quản Corning, Mỹ
Bảng 2: Thiết bị sử dụng
Tên Hãng sản xuất
Kính hiển vi huỳnh quang Axio Plan 2 Carl Zeiss – Đức Kính hiển vi laser quét LSM 510 Carl Zeiss – Đức Kính hiển vi soi ngƣợc Axiovert 40 CFL Carl Zeiss – Đức
Máy đọc ELISA BioLab – Mỹ
Máy ly tâm Universal 320 Hettich, Đức
Pipett aid Gibson
Tủ ấm 5% CO2 Shell Lab, Mỹ
Tủ hood Esco Mỹ
Tủ ổn nhiệt Gra Operation SS40-1 Đức
2.3. Hóa chất sử dụng
Bảng 3: Hóa chất sử dụng
Tên Hãng sản xuất
Alexa antimouse 488 Invitrogen, Mỹ
Anti-Histon H3PS10 Antibody Invitrogen, Mỹ Antitubulin antibody Invitrogen, Mỹ
Blue trypan Mỹ
BSA Merck, Đức
CellTiter 96®Aqueous Non- Radioactive Cell Proliferation Assay
DMEM Invitrogen, Mỹ
Ethanol Trung Quốc
FBS Invitrogen, Mỹ
Hoestch 3334 Invitrogen, Mỹ
Paraformaldehyde Merck, Đức
PBS Invitrogen, Mỹ
Peniciline/Streptomicin Invitrogen, Mỹ
Red Phalloidine Invitrogen, Mỹ
Trypsin Invitrogen, Mỹ
Tryton X Merck, Đức
2.4. Phƣơng pháp hoạt hóa và nhân ni các dịng tế bào in vitro
Tế bào đƣợc cất giữ trong Nito lạnh, đem rã đông trong tủ ổn nhiệt 37ºC. Chuyển dung dịch chứa tế bào vào ống falcon 15 mL đã có chứa dung dịch PBS, ly tâm 1000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
Hình 14: Các dịng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng
Phân tán tế bào lắng vào 5-7 mL mơi trƣờng ni cấy thích hợp, sục đều rồi cho vào đĩa petri 100 mm hoặc chai nuôi cấy T25 ủ trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2. Kiểm tra hàng ngày, thay môi trƣờng 2 ngày/lần, khi tế bào mọc kín
75-90% bề mặt đĩa thì thu hoạch hoặc tiến hành cấy chuyển tế bào sang đĩa nuôi cấy mới.
Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy bằng cách ủ với dung dịch Trypsin-EDTA 1X trong 5 phút ở 37ºC, 5% CO2. Trung hòa Trypsin bằng cách bổ sung với môi trƣờng nuôi cấy đã bổ sung FBS, hút dịch vào ống ly tâm, đem ly tâm 1000 rpm trong 5 phút.
Kiểm tra tỷ lệ tế bào chết bằng cách nhuộm với Blue trypan trong 3-5 phút rồi đếm trên buồng đếm tế bào. Nếu tỷ lệ chết < 10% tổng số tế bào thì tế bào đƣợc xem là đủ khỏe mạnh dùng để cấy chuyển tiếp tục hoặc dùng cho các mục đích thí nghiệm tiếp theo.
2.5. Phƣơng pháp thử độc tính MTS
Nguyên lý:
MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium) khi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ đƣợc tế bào chuyển hóa, tạo ra một sản phẩm formazan tan trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào, hấp thụ ánh sáng tối đa ở bƣớc sóng 490-500 nm trong đệm PBS. Lƣợng formazan tạo ra sẽ đƣợc định lƣợng bằng lƣợng ánh sáng ở bƣớc sóng 490nm bị hấp thụ và tỷ lệ thuận với lƣợng tế bào sống trong mơi trƣờng ni cấy đó. Phƣơng pháp MTS thƣờng đƣợc coi là phƣơng pháp MTT 1 bƣớc, có tính tiện lợi cao do chỉ cần bổ sung thẳng chất vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào mà không cần bất kỳ bƣớc rửa hay chuẩn bị nào khác.
Quy trình thí nghiệm
Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng
Mẫu C1 (µg/mL) C2 (µg/mL) C3 (µg/mL) C4 (µg/mL) C5 (µg/mL)
H, M, D 5 10 20 40 50
Taxol 0,003 0,03 0,3 3 30
Chuẩn bị tế bào: Với mỗi dòng tế bào, chuẩn bị dung dịch tế bào sao cho có 5.000TB/180 µL/giếng trên đĩa 96 giếng. Trộn nhẹ để tế bào phân tán đều trong các giếng, quan sát kiểm tra dƣới KHV đảo chiều, ủ ở 37o
C, 5% CO2 trong 24h để tế bào ổn định và bám vào bề mặt đĩa.
Chuẩn bị dung dịch thuốc trung gian và ủ chất: Pha dung dịch trung gian tƣơng ứng có nồng độ cao gấp 10 lần nồng độ cuối cần thử trong giếng. Bổ sung 20 µL dung dịch trung gian tƣơng ứng rồi lắc nhẹ để thuốc phân bố đều trong giếng, ủ 48h ở 37oC, 5% CO2, quan sát và ghi lại hình ảnh hàng ngày.
Ủ MTS và đo mật độ quang học: Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 1PMS:20 MTS. Thêm 30 µL hỗn hợp trên vào mỗi giếng đang chứa 200 µL dung dịch mơi trƣờng ni cấy đã đƣợc bổ sung thuốc và ủ với tế bào trong 48h. Ủ hỗn hợp trên trong 3h ở điều kiện 37oC, 5% CO2 rồi tiến hành đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 490nm. Dùng phần mềm Excel để xử lý số liệu, tính chỉ số IC50 – Là giá trị nồng độ chất thử tại đó chất thử có khả năng gây chết 50% tế bào.
Chỉ số IC50 của một chất với một dòng tế bào đƣợc tính từ nghiệm phƣơng trình hồi quy biểu diễn tƣơng quan giữa x là nồng độ hoặc log nồng độ chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A (%) của dịng tế bào đó khi đƣợc ủ với chất thử ở các nồng độ khác nhau, khi y = 50 (%).
A (%) đƣợc tính theo cơng thức: o A (%) = V/Vh x 100%
V: Chỉ số OD đo đƣợc ở trong giếng thí nghiệm
2.6. Phƣơng pháp thử độc tính trên mơ hình spheroid
Tạo giá thể cho khối spheroid bằng agarose 1,5% cho vào các giếng của đĩa 96. Chờ agarose đông lại tiến hành tạo giọt treo trên nắp đĩa 96 với mật độ 5.000TB/giọt treo.
Sau 2 ngày tạo giọt treo, khi quan sát thấy các tế bào dƣới tác dụng của trọng lực đã tạo thành cụm, tiến hành hạ giọt treo vào các giếng tƣơng ứng đã có giá thể agarose 1,5% và môi trƣờng nuôi cấy phù hợp.
Với thí nghiệm theo dõi tốc độ sinh trƣởng của khối spheroid
Theo dõi hàng ngày và thay môi trƣờng, chụp ảnh 2 ngày/lần cho đến khi khối spheroid phân rã.
Đo kích thƣớc khối spheroid và tính thể tích khối bằng phần mềm AxioVison L.E. R4.5, dựng đƣờng cong sinh trƣởng để biết quy luật tăng trƣởng của khối spheroid.
Với thí nghiệm kiểm tra tác động của H lên khả năng tạo khối spheroid
Sau khi tạo giá thể, tiến hành tạo giọt treo trên nắp đĩa 96 giếng với mật độ 5,000TB/giọt treo theo các nhóm mẫu thí nghiệm tƣơng ứng bằng mơi trƣờng có chứa H nồng độ (NĐ) 5µg/mL và mơi trƣờng có chứa H NĐ 10µg/mL.
Sau 2 ngày, tiến hành hạ giọt treo xuống các giếng chứa môi trƣờng hoặc môi trƣờng chứa H với nồng độ tƣơng ứng.
Theo dõi hàng ngày và thay môi trƣờng, chụp ảnh 2 ngày/lần
Đo kích thƣớc khối spheroid và tính thể tích khối bằng phần mềm AxioVison L.E. R4.5, dựng đƣờng cong sinh trƣởng của khối spheroid ở ba mẫu khác nhau và so sánh sự khác biệt xem liệu H có ảnh hƣởng đến q trình tạo khối spheroid hay khơng.
Với thí nghiệm theo dõi tác động của H lên quá trình tăng trƣởng khối spheroid
Sau khi tạo giá thể, tạo giọt treo và hạ giọt treo vào các giếng tƣơng ứng đã có giá thể agarose 1,5% và môi trƣờng nuôi cấy thƣờng, các khối spheroid hình thành đƣợc nuôi trong môi trƣờng 37o
C, 5% CO2.
Sau 5 ngày hạ giọt treo, tiến hành chia các giếng có chứa các khối spheroid đồng đều, phát triển khỏe mạnh thành ba nhóm mẫu: Đối chứng sinh học (ĐCSH), mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, và mẫu ủ H NĐ 20µg/mL. Theo dõi hàng ngày, thay mơi trƣờng tƣơng ứng và chụp ảnh 2 ngày/lần Đo kích thƣớc khối spheroid và tính thể tích khối bằng phần mềm
AxioVison L.E. R4.5, dựng đƣờng cong sinh trƣởng của khối spheroid, so sánh sự khác biệt xem H có tác động lên quá trình sinh trƣởng của khối spheroid hay không.
2.7. Phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang
Nồng độ thuốc thử:
H: 10 µg/mL và 20 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên actin) H, M, D: 10 µg/mL (với thí nghiệm kiểm tra tác động lên Aurora kinaza) Taxol: 0,3 µg/mL
Quy trình thí nghiệm
Chuẩn bị 4 đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm, mỗi đĩa chứa 04 coverglass. Bổ sung vào mỗi đĩa dung dịch chứa TBUT Hela nuôi với mật độ 500.000TB/2,25mL môi trƣờng. Các đĩa đƣợc chia thành 4 mẫu thí nghiệm tƣơng ứng gồm: ĐCSH, H NĐ 10µg/mL, H NĐ 20µg/mL và Taxol 0,3µg/mL
Sau 24h ni cấy cho tế bào ổn định, bám xuống bề mặt coverglass, tiến hành ủ thuốc với các nồng độ đã dự kiến.
Cố định mẫu khi thấy phần lớn các tế bào đã có biến đổi hình thái rõ rệt dƣới tác động của chất thử và vẫn đang bám ở trên đĩa.
Nhuộm mẫu theo các bƣớc nhƣ sau:
o Cố định mẫu bằng PFA 4% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
o Đục màng tế bào bằng TrytonX 0,5% ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. o Block các liên kết không đặc hiệu và bộc lộ các liên kết đặc hiệu bằng
cách ủ mẫu với BSA 5% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. - Với thí nghiệm kiểm tra tác động lên vi sợi actin:
o Nhuộm kháng thể 1 anti alpha-tubulin trong 1h ở nhiệt độ phòng, tránh sáng. Sau đó nhuộm kháng thể 2 M488 trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Nhuộm trực tiếp actin bằng Red-phalloidine trong 1h ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Nhuộm nhân bằng Hoechst 3334 trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Quan sát dƣới KHV huỳnh quang và ghi lại hình ảnh phân tích. - Với thí nghiệm kiểm tra tác động lên sự phosphoryl hóa Histone H3:
o Nhuộm kháng thể 1 anti histone H3 antibody trong 1h ở nhiệt độ phịng, tránh sáng. Sau đó, nhuộm kháng thể 2 M488 trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
o Nhuộm nhân bằng Hoechst 3334 trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, tránh sáng.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát đô ̣c tính của Honokiol , Magnolol và Derrone trê n mô
hình 2D
3.1.1. Với dòng HCT116
Sau 48h ủ với các chất thí nghiệm, tiến hành chụp ảnh mẫu dƣới KHV đảo chiều, thu đƣợc kết quả nhƣ sau: các tế bào HCT116 có kích thƣớc nhỏ, hình dạng dài.
Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x)
Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL (phải) (100x)
Khơng có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu ĐCDM ủ DMSO 0,125% với mẫu ĐCSH. Sau 48h ủ, ngay ở nồng độ thứ nhất (5µg/mL) H đã có tác dụng rõ rệt: 80% các tế bào co trịn lại. Ở nồng độ thứ hai (10µg/mL) các tế bào chỉ còn là các chấm
tròn nhỏ và khơng cịn sự khác biệt rõ rệt về hình thái với 3 nồng độ 20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL cịn lại.
Magnolol (M) tác động rõ rệt đến tế bào HCT116 theo xu hƣớng tƣơng tự ngay từ nồng độ 5µg/mL và cũng khơng có sự khác biệt rõ rệt về hình thái ở 4 nồng độ 10 µg/mL, 20µg/mL, 40µg/mL và 50µg/mL cịn lại.
Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL (phải) (100x)
Với Taxol, sau 48h ủ, ở nồng độ thứ nhất 0,003µg/mL tế bào đã có xu hƣớng co lại so với mẫu ĐCSH. Xu hƣớng này tăng rõ rệt theo chiều tăng nồng độ, các tế bào co lại thành dạng tròn và nhỏ dần từ nồng độ 0,03µg/mL, 0,3µg/mL, 3µg/mL đến 30µg/mL.
Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x)
Sau khi thực hiện phản ứng kiểm tra độc tính của chất bằng phƣơng pháp MTS, đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 490nm, chúng tơi sử dụng phần mềm
Excel để xử lý số liệu đo OD thu đƣợc. Kết quả tính chỉ số tăng sinh A (%) với