ST
T Tên ẫu N ày ấy
ẫu ị điể Tên lồi
Kí hiệu
1 TNSV-VP 4/2014 Vĩnh Ph c A.
conchinchinesis
TQ8
2 TNSV-H-KA2 2/4/2015 Khe Áo- Huế A. tertorius TQ11 3 TNSV-H-TP2 3/4/2015 Th c Phướn – Xã Hương
Ph , Nam Đ ng, Huế
A. tertorius TQ16
4 TNSV-H-CM4 17/3/2015 Khe Chà Măng- Xã Hương Ph , Nam Đ ng, Huế
A. tertorius TQ23
5 TNSV-H-KM1 26/3/2015 Khe Môn- Huế A. tertorius TQ25 6 TNSV–H–TS2 19/3/2015 Đường mòn Trĩ Sao- Huế A. tertorius TQ31 7 TNSV – KG5 1/4/2015 Kiên Giang- Ph Quốc A. tertorius TQ39 8 TNSV - SĐ 5/2015 Sơn Động- ắc Giang A. tertorius TQ40 9 TNSV – HB1 08/2015 Hịn Bà (khơng móc 1) km25- Nha Trang A. tertorius TQ41 10 TNSV – HB2 08/2015 Hịn Bà (khơng móc 2) km25- Nha Trang A. tertorius TQ42 11 TNSV – HB3 08/2015 Hịn Bà (có móc) km25 A. tertorius TQ43 12 TNSV - QT 29/7/2015 ắc Hướng Hóa- Quảng Tr A. tertorius TQ44 Ghi chú: Mẫu do chuyên gia Thực Vật của ảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thu, đ nh lồi, làm
2.2. Hó chất, thiết bị 2.2.1. Dụn cụ
Ống corning, pipette c c loại, đầu c n c c loại,chày cối sứ, ống eppendorf 2ml và 1,5ml, đĩa petri, đ n c n, que cấy, parafilm
2.2.2. Hó chất và dun dịch sử dụn
CTAB (Phụ lục), Isopropanol, ethanol, chloroform, KIT tinh sạch, agarose, đệm TAE 1X, Cao nấm men (Yeast extract), Trypton, bacto agar, X – gal, Ampicillin, IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactoside) do hãng Sigma cung cấp.
2.2.3. Tr n thiết bị
Lò vi sóng SHARP (Th i Lan), m y lắc n nhiệt 37o
C Thermo – Shaker (bioSan, Latvia), m y li tâm Centrifuge 80-2, tủ đ ng (SANAKY, Nhật ản), m y khuấy trộn Vortex (Mỹ), m y spin (Đài loan), m y PCR Systerm 9700 (Singapore), UV transilluminator (Đài Loan), cân phân tích 10-4 g (Vi RA, Nhật ản), tủ cấy v tr ng (Trung Quốc), n i khử tr ng (Trung Quốc), m y li tâm lạnh (Centrifuge 5415, eppendorf, Đức), bộ điện di NA (Anh), bể n nhiệt Julabo (Đức).
2.3. Ph n pháp n hiên cứu
2.3.1. Ph n pháp xử ý ẫu n hiên cứu
Mẫu l Trung quân thu ở c c đ a điểm kh c nhau đư c bảo quản trong c c t i nilong có chứa silicagel và đư c kí hiệu mẫu c n thận đến khi t ch NA.
2.3.2. Ph n pháp tách DNA tổn số t á
NA t ng số đư c t ch từ 50mg l Trung quân theo phương ph p của Doyle và Doyle (1990) có thay đ i cho ph h p với đi u kiện phịng thí nghiệm tại Việt Nam, cụ thể như sau:
Nghi n nhanh 50 mg mẫu l bằng chày cối sứ đã khử tr ng trong nitơ lỏng cho tới khi thành bột m n r i chuyển sang ống eppendorf 2 ml. Tiếp theo, b sung 800 µl dung d ch đệm chiết (100mM Tris – HCl pH8, 1,5M NaCl, 50mM EDTA pH8, 4% CTA ) đã chu n b trước. Sau đó, trộn đ u hỗn h p và ủ ở 650C trong 1 giờ c ch 15 ph t đảo một lần. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 ph t, b sung
800µl hỗn h p Chloroform-isoamyl alcohol (CI 24:1) và trộn hỗn h p bằng c ch đảo đ u ống trong 10 ph t. Sau đó, ly tâm tốc độ 13000rpm tại 4 C trong 15 ph t, thu pha d ch trên, loại pha d ch dưới. Chú ý: dùng pipette hút nhẹ nhàng pha trên sang một ống eppendorf sạch khác, tránh hút lẫn pha dưới (nên để lư ng hút nhỏ hơn lư ng dung d ch đệm đã sử dụng), chuyển pha lớp dung d ch trên sang ống eppendorf loại 1,5ml. Tiếp tục b sung 800µl isopropanol để kết tủa DNA, lắc đ u, ủ 30 ph t ở -200
C. Ly tâm tốc độ 13000rpm trong 15 ph t. Đ dung d ch lỏng đi, thu cặn tủa. B sung 500µl dung d ch ethanol 70%, ly tâm tốc độ 13000rpm trong 10 ph t để rửa DNA r i thu cặn tủa. Cuối cùng, làm khô DNA mẫu vừa tách trong tủ hút vơ trùng r i b sung 30µl nước khử ion chứa 20mg/ml RNAse (khơng chứa NAse) để hịa tan NA. NA t ch đư c bảo quản ở -20°C.
2.3.3. Ph n pháp nh n đ n en đích bằn kỹ thuật PCR
Phản ứng nhân gen đư c thực hiện với khuôn là:
NA t ng số của 12 mẫu l Trung quân n ng độ 100ng/µl (g m 96 µl H2O + 4 µl DNA) với c c m i đặc hiệu đư c thiết kế sử dụng phần m m NAStar (Mỹ), dựa trên những th ng tin v c c gen trong chi Trung quân (bảng 2.2). Phản ứng đư c thực hiện trong thể tích 25 µl với c c thành phần: 1X dung d ch đệm, 2mM dNTPs, 100nM m i, 100ng NA khu n và 0,5 đơn v Taq polymerase (bảng 2.3). T y thuộc vào từng m i và nhiệt độ bắt cặp của ch ng mà chu trình nhiệt đư c tối ưu kh c nhau, chu trình nhiệt cho c c cặp m i MatKF/R, ITS1/4, M13F/R (sử dụng để kiểm tra kích thước của đoạn gen ITS và MatK gắn vào vector) đư c trình bày
Bảng 2.2: Các mồi được sử dụng trong các phản ứng
Gen đích
Tên ồi Trình tự nuc e tide đề tài thiết kế các cặp ồi 5’ – 3’) Kích th ớc ý thuyết Nhiệt độ bắt cặp ồi) Ghi chú MatK MatKF 5 ‟ -TCGAATGTATCGACAGAATC-3‟ 1280bp 500C Meimberg et al (2010) MatKR 5‟-TAGGTCCTCTATATAACCTC-3‟ ITS
ITS1 5‟-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‟ 750bp 600C White et al. (1990) ITS4 5‟-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‟
Bảng 2.3: Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl
Thành phần phản ứn Nồn độ Thể tích
ream buffer (bao g m 20 mM MgCl2 ) 10X 2.5µl
dNTPs 10mM 2 µl
M i xu i (F) 10 pmol/µl 0.5 µl M i ngư c(R) 10 pmol/µl 0.5 µl Dream Taq DNA- polymerase 10u/µl 0.5 µl
DNA khn 100ng/ µl 2 µl
H2O 17 µl
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn gen MatK C c giai C c giai đoạn C c bước của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ Giai đoạn 1 iến tính ban đầu 940C 3 phút 1 Giai đoạn 2 ước 1: iến tính 940C 30 giây
30 ước 2:Gắn m i 500C 30 giây
ước 3:T ng h p 720C 1 phút
Giai đoạn 3 Hồn thiện chu trình 720C 7 phút 1 Giai đoạn 4 Kết th c phản ứng 40C ∞ 1
Bảng 2.5: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân trình tự đoạn ITS
C c giai đoạn C c bước của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ Giai đoạn 1 iến tính ban đầu 940C 3 phút 1 Giai đoạn 2 ước 1: iến tính 940C 30 giây
30 ước 2:Gắn m i 600C 30 giây
ước 3:T ng h p 720C 1 phút
Giai đoạn 3 Hồn thiện chu trình 720C 7 phút 1 Giai đoạn 4 Kết th c phản ứng 40C ∞ 1
Bảng 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi M13F/R
C c giai đoạn C c bước của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ Giai đoạn 1 iến tính ban đầu 940C 3 phút 1 Giai đoạn 2 ước 1: iến tính 940C 30 giây
30 ước 2:Gắn m i 520C 30 giây
ước 3:T ng h p 720C 1 phút
Giai đoạn 3 Hồn thiện chu trình 720C 7 phút 1 Giai đoạn 4 Kết th c phản ứng 40C ∞ 1
2.3.4. Tinh s ch sản ph PCR
Sản ph m PCR đư c tinh sạch theo bộ kit tinh sạch Wizard SV Gel and PCR clean-up System (Promega). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ c c hóa chất dư thừa cũng như những sản ph m thừa (m i, đệm PCR, c c nucleotide) có thể có trong sản ph m PCR mà qu trình điện di kh ng ph t hiện đư c. Quy trình tinh sạch đư c thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể g m c c bước sau:
Sau khi điện di 25µl sản ph m PCR trên gel agarose 1%, cắt băng chứa đoạn NA cần tinh sạch từ gel và chuyển phần gel chứa băng NA vào ống eppendorf r i x c đ nh khối lư ng đoạn gel đó. Sau đó, b sung thêm 10 µl Membrane inding Solution cho mỗi 10g gel hòa tan gel tại 500 C trong 10 ph t và hút d ch gel đã hịa tan hồn toàn sang cột tinh sạch ly tâm 13000 rpm trong 1 ph t, loại d ch lỏng. Tiếp tục b sung 700 µl Membrane Wash Solution, ly tâm 13000 rpm trong 1 ph t loại d ch lỏng và lặp lại bước này với 500 µl Membrane Wash Solution r i ly tâm 5 phút để thu lại sản ph m PCR đã tinh sạch. Lấy cột ra khỏi ống chuyển sang ống 1,5 ml b sung 25 µl H20 trực tiếp vào giữa màng lọc trong cột để ở nhiệt độ phòng 1 ph t sau đó ly tâm 13000 rpm trong 1 ph t. D ch thu đư c ở ống eppendorf dưới cột là mẫu NA tinh sạch.
2.3.5. Gắn sản ph PCR và vect r tách d n pTZ57 R/T
Qu trình t ch dịng đư c thực hiện bằng c ch gắn trực tiếp sản ph m phản ứng PCR vào vector t ch dòng pTZ57 R/T với mục đích tạo vector t i t h p mang đoạn NA cần phân lập và sau đó biến nạp vào tế bào E. coli chủng H5α.
Nguyên tắc: Phản ứng dựa vào phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5‟ của sản ph m PCR với base Thymine ở đầu 3‟ của vector t ch dịng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Hỗn h p phản ứng đư c thực hiện ở nhiệt độ 220 C (nhiệt độ tối ưu cho enzyme Topoisomerase hoạt động) với các thành phần chính như vector pTZ57 R/T, sản PCR cần gắn, dung d ch lai và enzyme gắn T4 ligase (bảng 2.7)
Bảng 2.7. Thành phần cho phản ứng lai ghép
Lai ghép Thể tích
Vector mở vịng: vector pTZ57 R/T 1µl
ung d ch lai: 5X Ligation Buffer 2 µl Sản ph m PCR 5 µl
H20 1 µl
T4 DNA Ligase 1 µl
T ng 10 µl
Hình 2.1. Cấu trúc vect r tách d n pTZ57 R/T (Thermo, ức)
2.3.6. Biến n p DNA P s id và tế bà E.coli DH5α.
Vector pTZ57 R/T sau khi đư c gắn gen sẽ biến nạp vào tế bào vi khu n E. Coli H5α và nhờ sự tr gi p của bộ m y tế bào vi khu n để t ng h p plasmid t i
Qu trình này g m 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp. * Tạo tế bào khả biến:
Tế bào E. coli DH5α đư c nu i qua đêm trong m i trường L lỏng ở 370C sẽ đư c d ng để tạo tế bào khả biến. Tiếp theo, chuyển d ch khu n sang ống nu i mới với tỷ lệ 1ml khu n nuôi qua đêm + 10ml môi trường L và tiếp tục nu i lắc ở đi u kiện 370C, 200vòng/phút trong 3-4 tiếng cho tới khi đạt O 600=0.5-0.7 r i tiến hành ly tâm 5000 vòng/ ph t, 40C trong 5 ph t và thu cặn tế bào. Sau đó, b sung 1ml CaCl2 0,1M vào ống khu n, hòa tan cặn khu n và để d ch hòa tan trong đ 15 ph t. Tiếp tục thu cặn tế bào bằng c ch ly tâm 5000 vòng/ ph t ở 40C trong 5 ph t. Cuối c ng, b sung dung d ch CaCl2 0,1M và hòa tan cặn tế bào và chia vào các ống eppendorf đã khử tr ng r i giữ ở -80oC cho tới khi cần sử dụng.
* iến nạp
Tế bào khả biến sau khi lấy từ tủ âm sâu sẽ đư c làm tan trên đ r i b sung 5 µl sản ph m lai r i trộn với tế bào trong ống và để trên đ 15 ph t sau đó cho sốc nhiệt bằng c ch chuyển ống tế bào sang bể n nhiệt 420
C trong 1 ph t r i lại chuyển vào đ trong 5 ph t. Tế bào đư c n đ nh bằng c ch b sung 200 µl m i trường L lỏng, và nu i lắc trong đi u kiện 200vòng/phút ở 370C trong 1 tiếng. Chu n b c c đĩa L đặc có b sung Ampicillin 50mg/l, X-gal 0,004% và IPTG 100µM và cấy trải khu n trên đĩa nu i ở 370C qua đêm.
2.3.7. Tách chiết DNA p s id
Chọn 10 khu n lạc trắng mọc riêng rẽ, cấy vào m i trường L lỏng có b sung Ampicillin 50mg/l, nu i lắc 220vòng/phút ở 370C qua đêm. Sau đó d ch huy n phù vi khu n đư c sử dụng để t ch plasmid theo quy trình sau:
Đ 2ml d ch khu n vào ống eppendorf 2ml. Tiếp theo, ly tâm tốc độ 5000rpm trong 5 phút tại 40C. Đ d ch lỏng, thu cặn tế bào. sung 100µl sol I, hòa tan cặn khu n. sung 200µl sol II, trộn đ u bằng c ch lắc đảo ngư c ống. sung 150µl sol III, trộn đ u bằng c ch lắc đảo ngư c ống. sung 450µl C:I và đảo đ u. Ly tâm 13000 rpm trong 15 ph t r i h t pha trên chuyển sang ống eppendorf 1.5ml. Tủa DNA bằng 450µl isopropanol ở -20 độ C trong 1 tiếng. Tiếp tục ly tâm
13000 rpm trong 15 ph t r i thu cặn. sung 500µl Ethanol 70% và ly tâm 15 ph t r i thu cặn. Làm khơ cặn trong tủ cấy vơ trùng và hịa tan trong 30-50 µl H20.
Sử dụng phương ph p PCR với cặp m i M13F và M13R nằm gần hai đầu v trí cắt mở vòng của vector pTZ57 R/T để kiểm tra kích thước đoạn gen gắn vào vector.
2.3.8. Ph n pháp điện di kiể tr kết quả
Sản ph m PCR và NA t ng số đư c kiểm tra bằng kĩ thuật điện di trên gel agarose 0,8% trong dung d ch TAE 1X (40 mM Tris pH=8, 20mM acetic acid, 1 mM E TA) và nhuộm gel bằng Ethidium romide trong 10 ph t, đọc kết quả trên máy geldoc (UV transilluminator-Đài Loan). Chọn c c plasmid có băng PCR dương tính và gửi đi x c đ nh trình tự nucleotide ở c ng ty I T (Singapore).
2.3.9. Ph n pháp phân tích trình tự nuc e tide và phân tích cây phát sinh chủn i.
Trình tự nucleotide của MatK và ITS của một số loài trong chi Trung quân đư c tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế Genbank/EM L qua c ng cụ tìm kiếm BLAST (www. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). ữ liệu trình tự của mẫu
phân tích và dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen sẽ đư c chu n b để phân tích khoảng c ch di truy n giữa c c mẫu bằng c ch sử dụng phần m m MEGA phiên bản 3.1 (Kumar et al., 2004). Sử dụng phương ph p Neighbour-joining (NJ) và mơ hình khoảng c ch Kimura 2-Parameter (Kimura, 1980) có trong phần m m MEGA để xây dựng cây ph t sinh chủng loại của MatK và ITS. Độ tin cậy của c c nh nh trên cây phát sinh chủng loại NJ đư c thực hiện với 1000 lần lặp lại hay còn gọi là gi tr bootstrap 1000 (Kumar et al., 2004). Khi phân tích cây ph t sinh chủng loại chúng tôi dựa trên trình tự đoạn ITS và MatK để phân chia 12 mẫu Trung quân
thành các nhóm chính.
Trình tự nucleotide từ từng đoạn chỉ th MatK và ITS trên ngân hàng gen và từ c c mẫu Trung quân Việt Nam đư c so s nh với nhau bằng phương ph p ClusterW có trong phần m m NASTAR và Sequence ata Explorer có trong phần m m
MEGA3.1 (Kumar et al., 2004). Những nucleotide thay thế trong c c trình tự này đư c phân tích để giải thích sự đa dạng của c c mẫu Trung quân nghiên cứu.
Ch n 3: KẾT QUẢ V THẢO UẬN 3.1. Kết quả tách DNA tổn số
Qui trình t ch chiết NA t ng số là một trong những qui trình khởi đầu cho c c kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng, đóng vai trị thiết yếu trong c c nghiên cứu ở mức độ gen, và đặc biệt quan trọng đối với những phân tích đa dạng di truy n dựa trên sự đa hình của c c sản ph m PCR. T ch chiết NA t ng số bằng đệm có CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium romide) là phương ph p t ch c điển đư c sử dụng chủ yếu ở nhi u loài thực vật ( oyle and oyle, 1990). CTA là chất t y rửa có khả năng ph v hệ thống màng tế bào và loại polysaccharide khỏi NA t ng số (Zeng et al., 2002). 5 µl NA t ng số sau khi t ch chiết đư c điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, minh họa trên hình 3.1.
Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu Trung Quân
ăng điện di thu đư c từ c c mẫu Trung quân đ u kh rõ nét chứng tỏ DNA t ng số có đủ chất lư ng. Từ hình 3.1 cho thấy việc t ch NA t ng số thành c ng, DNA có đủ chất lư ng cho c c phản ứng nhân gen chỉ th tiếp theo. Hơn nữa, sự
Trung, Nam cho thấy qu trình bảo quản mẫu l trong silicagel là thích h p để có thể lưu giữ mẫu vật đảm bảo chất lư ng trong suốt qu trình thu mẫu. Quy trình t ch chiết NA sử dụng CTA như đã m tả trong phần 2.2 là ph h p với thí