C c giai đoạn C c bước của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ Giai đoạn 1 iến tính ban đầu 940C 3 phút 1 Giai đoạn 2 ước 1: iến tính 940C 30 giây
30 ước 2:Gắn m i 600C 30 giây
ước 3:T ng h p 720C 1 phút
Giai đoạn 3 Hồn thiện chu trình 720C 7 phút 1 Giai đoạn 4 Kết th c phản ứng 40C ∞ 1
Bảng 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi M13F/R
C c giai đoạn C c bước của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ Giai đoạn 1 iến tính ban đầu 940C 3 phút 1 Giai đoạn 2 ước 1: iến tính 940C 30 giây
30 ước 2:Gắn m i 520C 30 giây
ước 3:T ng h p 720C 1 phút
Giai đoạn 3 Hồn thiện chu trình 720C 7 phút 1 Giai đoạn 4 Kết th c phản ứng 40C ∞ 1
2.3.4. Tinh s ch sản ph PCR
Sản ph m PCR đư c tinh sạch theo bộ kit tinh sạch Wizard SV Gel and PCR clean-up System (Promega). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ c c hóa chất dư thừa cũng như những sản ph m thừa (m i, đệm PCR, c c nucleotide) có thể có trong sản ph m PCR mà qu trình điện di kh ng ph t hiện đư c. Quy trình tinh sạch đư c thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể g m c c bước sau:
Sau khi điện di 25µl sản ph m PCR trên gel agarose 1%, cắt băng chứa đoạn NA cần tinh sạch từ gel và chuyển phần gel chứa băng NA vào ống eppendorf r i x c đ nh khối lư ng đoạn gel đó. Sau đó, b sung thêm 10 µl Membrane inding Solution cho mỗi 10g gel hòa tan gel tại 500 C trong 10 ph t và hút d ch gel đã hịa tan hồn toàn sang cột tinh sạch ly tâm 13000 rpm trong 1 ph t, loại d ch lỏng. Tiếp tục b sung 700 µl Membrane Wash Solution, ly tâm 13000 rpm trong 1 ph t loại d ch lỏng và lặp lại bước này với 500 µl Membrane Wash Solution r i ly tâm 5 phút để thu lại sản ph m PCR đã tinh sạch. Lấy cột ra khỏi ống chuyển sang ống 1,5 ml b sung 25 µl H20 trực tiếp vào giữa màng lọc trong cột để ở nhiệt độ phòng 1 ph t sau đó ly tâm 13000 rpm trong 1 ph t. D ch thu đư c ở ống eppendorf dưới cột là mẫu NA tinh sạch.
2.3.5. Gắn sản ph PCR và vect r tách d n pTZ57 R/T
Qu trình t ch dịng đư c thực hiện bằng c ch gắn trực tiếp sản ph m phản ứng PCR vào vector t ch dòng pTZ57 R/T với mục đích tạo vector t i t h p mang đoạn NA cần phân lập và sau đó biến nạp vào tế bào E. coli chủng H5α.
Nguyên tắc: Phản ứng dựa vào phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5‟ của sản ph m PCR với base Thymine ở đầu 3‟ của vector t ch dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Hỗn h p phản ứng đư c thực hiện ở nhiệt độ 220 C (nhiệt độ tối ưu cho enzyme Topoisomerase hoạt động) với các thành phần chính như vector pTZ57 R/T, sản PCR cần gắn, dung d ch lai và enzyme gắn T4 ligase (bảng 2.7)
Bảng 2.7. Thành phần cho phản ứng lai ghép
Lai ghép Thể tích
Vector mở vịng: vector pTZ57 R/T 1µl
ung d ch lai: 5X Ligation Buffer 2 µl Sản ph m PCR 5 µl
H20 1 µl
T4 DNA Ligase 1 µl
T ng 10 µl
Hình 2.1. Cấu trúc vect r tách d n pTZ57 R/T (Thermo, ức)
2.3.6. Biến n p DNA P s id và tế bà E.coli DH5α.
Vector pTZ57 R/T sau khi đư c gắn gen sẽ biến nạp vào tế bào vi khu n E. Coli H5α và nhờ sự tr gi p của bộ m y tế bào vi khu n để t ng h p plasmid t i
Qu trình này g m 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp. * Tạo tế bào khả biến:
Tế bào E. coli DH5α đư c nu i qua đêm trong m i trường L lỏng ở 370C sẽ đư c d ng để tạo tế bào khả biến. Tiếp theo, chuyển d ch khu n sang ống nu i mới với tỷ lệ 1ml khu n nuôi qua đêm + 10ml môi trường L và tiếp tục nu i lắc ở đi u kiện 370C, 200vòng/phút trong 3-4 tiếng cho tới khi đạt O 600=0.5-0.7 r i tiến hành ly tâm 5000 vòng/ ph t, 40C trong 5 ph t và thu cặn tế bào. Sau đó, b sung 1ml CaCl2 0,1M vào ống khu n, hòa tan cặn khu n và để d ch hòa tan trong đ 15 ph t. Tiếp tục thu cặn tế bào bằng c ch ly tâm 5000 vòng/ ph t ở 40C trong 5 ph t. Cuối c ng, b sung dung d ch CaCl2 0,1M và hòa tan cặn tế bào và chia vào các ống eppendorf đã khử tr ng r i giữ ở -80oC cho tới khi cần sử dụng.
* iến nạp
Tế bào khả biến sau khi lấy từ tủ âm sâu sẽ đư c làm tan trên đ r i b sung 5 µl sản ph m lai r i trộn với tế bào trong ống và để trên đ 15 ph t sau đó cho sốc nhiệt bằng c ch chuyển ống tế bào sang bể n nhiệt 420
C trong 1 ph t r i lại chuyển vào đ trong 5 ph t. Tế bào đư c n đ nh bằng c ch b sung 200 µl m i trường L lỏng, và nu i lắc trong đi u kiện 200vòng/phút ở 370C trong 1 tiếng. Chu n b c c đĩa L đặc có b sung Ampicillin 50mg/l, X-gal 0,004% và IPTG 100µM và cấy trải khu n trên đĩa nu i ở 370C qua đêm.
2.3.7. Tách chiết DNA p s id
Chọn 10 khu n lạc trắng mọc riêng rẽ, cấy vào m i trường L lỏng có b sung Ampicillin 50mg/l, nu i lắc 220vịng/phút ở 370C qua đêm. Sau đó d ch huy n phù vi khu n đư c sử dụng để t ch plasmid theo quy trình sau:
Đ 2ml d ch khu n vào ống eppendorf 2ml. Tiếp theo, ly tâm tốc độ 5000rpm trong 5 phút tại 40C. Đ d ch lỏng, thu cặn tế bào. sung 100µl sol I, hịa tan cặn khu n. sung 200µl sol II, trộn đ u bằng c ch lắc đảo ngư c ống. sung 150µl sol III, trộn đ u bằng c ch lắc đảo ngư c ống. sung 450µl C:I và đảo đ u. Ly tâm 13000 rpm trong 15 ph t r i h t pha trên chuyển sang ống eppendorf 1.5ml. Tủa DNA bằng 450µl isopropanol ở -20 độ C trong 1 tiếng. Tiếp tục ly tâm
13000 rpm trong 15 ph t r i thu cặn. sung 500µl Ethanol 70% và ly tâm 15 ph t r i thu cặn. Làm khơ cặn trong tủ cấy vơ trùng và hịa tan trong 30-50 µl H20.
Sử dụng phương ph p PCR với cặp m i M13F và M13R nằm gần hai đầu v trí cắt mở vòng của vector pTZ57 R/T để kiểm tra kích thước đoạn gen gắn vào vector.
2.3.8. Ph n pháp điện di kiể tr kết quả
Sản ph m PCR và NA t ng số đư c kiểm tra bằng kĩ thuật điện di trên gel agarose 0,8% trong dung d ch TAE 1X (40 mM Tris pH=8, 20mM acetic acid, 1 mM E TA) và nhuộm gel bằng Ethidium romide trong 10 ph t, đọc kết quả trên máy geldoc (UV transilluminator-Đài Loan). Chọn c c plasmid có băng PCR dương tính và gửi đi x c đ nh trình tự nucleotide ở c ng ty I T (Singapore).
2.3.9. Ph n pháp phân tích trình tự nuc e tide và phân tích cây phát sinh chủn i.
Trình tự nucleotide của MatK và ITS của một số loài trong chi Trung quân đư c tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế Genbank/EM L qua c ng cụ tìm kiếm BLAST (www. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). ữ liệu trình tự của mẫu
phân tích và dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen sẽ đư c chu n b để phân tích khoảng c ch di truy n giữa c c mẫu bằng c ch sử dụng phần m m MEGA phiên bản 3.1 (Kumar et al., 2004). Sử dụng phương ph p Neighbour-joining (NJ) và mơ hình khoảng c ch Kimura 2-Parameter (Kimura, 1980) có trong phần m m MEGA để xây dựng cây ph t sinh chủng loại của MatK và ITS. Độ tin cậy của c c nh nh trên cây phát sinh chủng loại NJ đư c thực hiện với 1000 lần lặp lại hay còn gọi là gi tr bootstrap 1000 (Kumar et al., 2004). Khi phân tích cây ph t sinh chủng loại chúng tơi dựa trên trình tự đoạn ITS và MatK để phân chia 12 mẫu Trung qn
thành các nhóm chính.
Trình tự nucleotide từ từng đoạn chỉ th MatK và ITS trên ngân hàng gen và từ c c mẫu Trung quân Việt Nam đư c so s nh với nhau bằng phương ph p ClusterW có trong phần m m NASTAR và Sequence ata Explorer có trong phần m m
MEGA3.1 (Kumar et al., 2004). Những nucleotide thay thế trong c c trình tự này đư c phân tích để giải thích sự đa dạng của c c mẫu Trung quân nghiên cứu.
Ch n 3: KẾT QUẢ V THẢO UẬN 3.1. Kết quả tách DNA tổn số
Qui trình t ch chiết NA t ng số là một trong những qui trình khởi đầu cho c c kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng, đóng vai trị thiết yếu trong c c nghiên cứu ở mức độ gen, và đặc biệt quan trọng đối với những phân tích đa dạng di truy n dựa trên sự đa hình của c c sản ph m PCR. T ch chiết NA t ng số bằng đệm có CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium romide) là phương ph p t ch c điển đư c sử dụng chủ yếu ở nhi u loài thực vật ( oyle and oyle, 1990). CTA là chất t y rửa có khả năng ph v hệ thống màng tế bào và loại polysaccharide khỏi NA t ng số (Zeng et al., 2002). 5 µl NA t ng số sau khi t ch chiết đư c điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, minh họa trên hình 3.1.
Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu Trung Quân
ăng điện di thu đư c từ c c mẫu Trung quân đ u kh rõ nét chứng tỏ DNA t ng số có đủ chất lư ng. Từ hình 3.1 cho thấy việc t ch NA t ng số thành c ng, DNA có đủ chất lư ng cho c c phản ứng nhân gen chỉ th tiếp theo. Hơn nữa, sự
Trung, Nam cho thấy qu trình bảo quản mẫu l trong silicagel là thích h p để có thể lưu giữ mẫu vật đảm bảo chất lư ng trong suốt qu trình thu mẫu. Quy trình t ch chiết NA sử dụng CTA như đã m tả trong phần 2.2 là ph h p với thí nghiệm t ch NA t ng số từ mẫu l Trung quân.
3.2. Kết quả nh n các đ n chỉ thị bằn ph n pháp PCR
Nhằm nhân đư c c c chỉ th phân tử, nghiên cứu đã sử dụng cặp m i MatKF/MatKR cho đoạn gen MatK với kích thước khoảng 1280bp và cặp m i
ITS1/ITS4 cho đoạn gen ITS với kích thước khoảng 750bp. Hình 3.2 và 3.3 minh họa kết quả điện di sản ph m PCR trên gel agarose 1% ở 100V/30p/250mA đ u cho các sản ph m PCR có chất lư ng tốt với một băng rõ duy nhất kh ng có băng phụ. Từ NA của c c mẫu Trung quân thu đư c c ng cặp m i MatKF/MatKR, sản ph m PCR thu đư c có kích thước khoảng 1300bp, tương ứng với kích thước tính to n lý thuyết 1280bp ban đầu (hình 3.2). Tương tự, kết quả điện di (hình 3.3) đối với cặp m i ITS1/ITS4 đã cho c c băng có kích thước tương ứng 750bp. Từ kết quả trên cho thấy hai đoạn ITS và MatK đã đư c nhân lên thành c ng ở 12 mẫu Trung quân nghiên cứu.
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu Trung quân bằng mồi MatKF- MatKR
Chú thích: ĐC (-): Đối chứng âm, M- thang chu n NA 1 kb (Fermentas). TQ8 TQ11 TQ16 TQ23 TQ25 TQ31 TQ39 TQ40 TQ41 /C(-) M TQ42 TQ43 TQ44 Đ/C(-) M
1500 bp 1000 bp
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu Trung quân bằng mồi ITS1-ITS4
Chú thích: ĐC (-): Đối chứng âm, M- thang chu n NA 1 kb (fermentas). 3.3. Kết quả gắn sản ph PCR và vect r tách d n pTZ57 R/T
Nhằm x c đ nh chính x c trình tự c c đoạn gen đã đư c nhân bản, c c sản ph m PCR thu đư c từ 12 mẫu Trung quân nghiên cứu đư c tinh sạch bằng kit Wizard SV Gel và PCR clean-up System (Promega), sau đó dịng hóa vào vector nhân dòng pTZ57 R/T nhằm nhân một số lư ng lớn c c vector t i t h p phục vụ cho thí nghiệm đọc trình tự. Vector pTZ57 R/T (hình 2.1) có mang operon Lac, gi p tạo c c khu n lạc xanh/trắng kh c biệt, thích h p cho việc lựa chọn c c dịng dương tính. Những khu n lạc màu xanh xuất hiện do vector pTZ57 R/T hoạt động bình thường, do đó tạo nên protein LacZα, kết h p với phần cịn lại đư c mã hóa trong genome của tế bào E.coli chủng H5α để tạo thành β- galactosidase, enzyme này thủy phân cơ chất X-gal có mặt trong m i trường để tạo nên sản ph m có màu xanh. Trong khi đó, c c khu n lạc có màu trắng hình thành từ c c tế bào mang plasmid có operon Lac kh ng hoạt động do đoạn NA ngoại lai xen vào v trí của gen cấu tr c LacZα dẫn đến kh ng t ng h p đư c enzyme β- galactosidase cần cho sự chuyển hóa X- gal. Ngồi ra, vector này cịn chứa gen bla quy đ nh tính kh ng
với Ampicillin.
o vậy, trong m i trường có b sung kh ng sinh chọn lọc Ampicillin và cơ chất X- gal và IPTG, c c khu n lạc mang vector t i t h p sẽ có màu trắng trong khi
TQ8 TQ11 TQ16 TQ23 TQ25 TQ31 TQ39 TQ40 TQ41 /C -) M TQ42 TQ43 TQ44 C -) M
c c khu n lạc mang vector pTZ57 R/T kh ng có đoạn NA ch n vào sẽ có màu xanh (hình 3.4).
Hình 3.4. Đĩa nuôi cấy xuất hiện khuẩn lạc xanh (không khoanh trịn) và trắng (khoanh trịn) trên mơi trường có kháng sinh ampicillin X- gal và IPTG
Trên đĩa petri, khu n lạc xanh trắng xuất hiện riêng rẽ. Như vậy, việc lựa chọn c c khu n lạc trắng để t ch plasmid có thể loại bỏ đư c phần lớn c c trường h p kh ng mong muốn mặc d kh ng phải tất cả c c khu n lạc trắng đ u có thể mang vector t i t h p chứa đoạn NA cần thiết. Để khẳng đ nh hơn, DNA plasmid đã sẽ đư c t ch chiết từ c c khu n lạc trắng và đoạn gen ch n vào đư c nhân lên bằng phản ứng PCR với m i M13F/R có trên vector pTZ57 R/T. Theo sơ đ vector pTZ57 R/T (hình 2.1), cặp m i M13F/M13R đư c thiết kế ở v trí tương ứng là nt599-nt614 và nt735-nt731. M i M13F/M13R đư c thiết kế nằm trên vector pTZ57 R/T và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm nt615-nt695. Khoảng c ch giữa hai m i trên vector vào khoảng 250bp. o đó khi tiến hành phản ứng colony – PCR các khu n lạc trắng do vector tự đóng vịng sẽ thu đư c băng có kích thước khoảng 250, còn với plasmid t i t h p nhân đư c đoạn gen sẽ có kích thước cộng thêm
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng mồi M13F/R của trình tự đoạn ITS đã được gắn vào vector pTZ57 R/T
Chú thích: M- thang chu n NA 1 kb (fermentas), (Giếng 1 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(1)-pTZ57R/T; giếng 2 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(2)-pTZ57R/T; giếng 3 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(3)- pTZ57R/T; giếng 4 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(4)-pTZ57R/T; giếng 5 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(5)-pTZ57R/T; giếng 6 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(6)-pTZ57R/T; giếng 7 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(7)- pTZ57R/T; giếng 8 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(8)-pTZ57R/T; giếng 9 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(9)-pTZ57R/T; giếng 10 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(10)-pTZ57R/T; giếng 11 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(11)-pTZ57R/T; giếng 12 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8ITS(12)- pTZ57R/T).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng mồi M13F/R của trình tự đoạn gen MatK đã được gắn vào vector pTZ57 R/T
Chú thích: M- thang chu n NA 1 kb (fermentas), (Giếng 1 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(1)-pTZ57R/T); giếng 2 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(2)-pTZ57R/T); giếng 3 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(3)- pTZ57R/T; giếng 4 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(4)-pTZ57R/T; giếng 5 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(5)-pTZ57R/T; giếng 6 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(6)-pTZ57R/T; giếng 7 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(7)-pTZ57R/T; giếng 8 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(8)- pTZ57R/T; giếng 9 là sản ph m PCR từ plasmid TQ8MatK(8)-pTZ57R/T).
Trải qua 20h sinh trưởng trên m i trường L có b sung Amp chọn lọc, 12