CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm
2.3.2.1. Tổng hợp vật liệu nano Ag/silica [5,25]
Chuẩn bị hố chất: hồ tan hoàn toàn AgNO3 và NaBH4 trong nước cất để được các dung dịch AgNO3 10g/l, NaBH4 0,1%.
Silica trước khi đem biến tính được để hút ẩm trong khơng khí cho no nước. Cân 500g silica đã no nước, thêm dung dịch AgNO3 10g/l, khuấy đều khoảng 15 phút, sau đó nhỏ từ từ dung dịch NaBH4 1% với tốc độ 1 giọt/1 giây, khi đo màu vật liệu chuyển dần sang màu vàng, khuấy đều thêm trong 15 phút. Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn, vật liệu được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất. Sau đó sấy khơ ở 50oC trong khoảng 5h, chú ý không nên sấy quá khô để tránh hạt vật liệu bị vỡ khi sử dụng. Tồn bộ quy trình tổng hợp được thể hiện trên hình 2.1.
Phản ứng giữa bạc nitrat và natribohydrat xảy ra như sau: AgNO3 + NaBH4 → Ag + ½H2 + ½B2H6 +NaNO3
Trong nghiên cứu của Sally và cộng sự (2007), khi nồng độ của NaBH4 gấp hai lần nồng độ của AgNO3 thì hạt nano bạc đạt trạng thái ổn định, các hạt nano bạc không bị co cụm lại với nhau tạo kết tủa [30].
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tổng hợp vật liệu nano Ag/silica 2.3.2.2. Đánh giá khả năng khử trùng của vật liệu
Chuẩn bị mẫu nước thử nghiệm
Chuẩn bị mẫu nước thử nghiệm có chứa coliforms bằng cách cho một thể
tích nước sơng Kim Ngưu sau khi lọc bỏ chất rắn lơ lửng vào 5 lít nước máy, khuấy đều, được mẫu nước thử nghiệm. Tiến hành khảo sát tổng số coliforms trong mẫu
Dung dịch AgNO3 10g/l
Ag+/silica
Dung dịch NaBH4 1% Nano Ag/silica
Rửa sạch và sấy khô ở 50oC trong 5h Khuấy đều trong 15 phút Khuấy đều trong 15 phút Tốc độ 1 giọt/giây Vật liệu nano Ag/silica 200ppm Hạt silica
nước thử nghiệm song song với các lần làm thí nghiệm. Mẫu nước thử nghiệm được chuẩn bị hàng ngày.
Đánh giá khả năng khử trùng theo phương pháp tĩnh và phương pháp động Đối với phương pháp tĩnh sẽ thực hiện khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc và tỷ lệ rắn/lỏng. Ảnh hưởng của chiều cao cột, tốc độ dòng, hàm lượng chất hữu cơ và một số ion thường gặp trong nước được khảo sát theo phương pháp động. Thí nghiệm cụ thể được trình bày trong phần 3.2 và 3.3.
Khảo sát khả năng khử trùng mẫu nước thực của vật liệu
Để đánh giá khả năng ứng dụng trong thực tế, thực hiện khảo sát khử trùng bằng nước cấp thành phố với một cột vật liệu có thể tích 0,7lít, đường kính cột 6.5cm, tốc độ dịng 50l/h. Thí nghiệm cụ thể được trình bày trong phần 3.4.
2.3.2.3. Định lượng coliforms
Rửa và khử trùng dụng cụ
Dụng cụ thí nghiệm phải rửa thật sạch, sau đó ngâm trong dung dịch HCl hay H2SO4 1-2% rồi rửa nước thật kỹ và sấy khô. Đối với các dụng cụ thủy tinh có dính mỡ, vazơlin, dầu… trước khi rửa cần lấy một ít bơng tẩm etanol để lau cho sạch. Các vết mỡ, các vết hóa chất, mơi trường cịn dính lại trên các dụng cụ thủy tinh sẽ có ảnh hưởng xấu đến kết quả thí nghiệm. Các dụng cụ sau khi đã sấy khô đem cất vào những nơi sạch sẽ, khi nào sử dụng mới bỏ ra khỏi bao. Giấy lọc dùng để lọc mẫu sau khi thí nghiệm khử trùng bằng phương pháp tĩnh cũng đem sấy, khi nào dùng mới bỏ ra.
Các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật sau khi rửa sạch sấy khô phải được khử trùng cẩn thận bằng cách chiếu đèn UV trong 5-10 phút để khử trùng.
Phễu lọc hút chân không được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Trong qua trình thí nghiệm, phễu lọc được khử trùng trong nước đun sôi 15 phút.
Chuẩn bị môi trường thạch Endo
Đây là mơi trường dinh dưỡng thích hợp để định lượng coliforms và E. coli trong nước và trong thực phẩm. Ngoài ra, người ta cũng có thể định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí khi điều chỉnh pH ổn định.
Thành phần cho 1L môi trường thạch Endo: - 10g pepton - 10g cao thịt - 10g lactozơ - 5g NaCl - 15g Agar - 2,5g Na2SO3 - 0,4g fuchsin bazơ - 1000ml nước cất
Hòa tan trước fuchsin bazơ trong 500ml nước cất, đun nhẹ trong cốc chịu nhiệt vì fuchsin bazơ khó hịa tan hơn các chất cịn lại. Sau đó thêm hỗn hợp các chất còn lại vào cốc, hịa tan hồn tồn, thêm nước cất đủ 1000ml thu được môi trường thạch Endo. Sau đó, mơi trường được đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Tiến hành đổ khoảng 10-15ml môi trường lên đĩa petri trong tủ cấy ngay khi cịn nóng với độ dày lớp thạch bằng khoảng ½ chiều cao đĩa petri.
Định lượng coliforms Nguyên tắc
Nuôi cấy một lượng mẫu nhất định lên môi trường Endo. Mơi trường Endo có chứa natri sulfit và fuchsin có khả năng ức chế vi sinh vật gram dương. Trong q trình phát triển trên mơi trường này, coliforms lên men đường lactozơ tạo thành anđehit và axit, anđehit tác động đến phức chất fuchsin-sulfit và giải phóng fuchsin,
sau đó fuchsin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến đỏ cánh sen, trịn, bờ đều, có ánh kim hoặc khơng.
Tiến hành
Chuẩn bị mẫu nước thử nghiệm. Sử dụng vật liệu đã tổng hợp được để khử trùng các mẫu nước. Các mẫu nước đầu vào và mẫu nước sau khi được khử trùng bằng vật liệu nano Ag/silica đem ni cấy theo quy trình như sau:
Lọc mẫu
Lắp đặt vô trùng màng lọc lên trên đĩa đệm của giá đỡ bằng panh vô trùng, mặt nhẵn ở trên sau khi đã tháo phễu lọc ra. Phễu lọc vơ trùng được lắp khít lại trên mặt màng lọc, dùng kẹp vơ trùng kẹp khít phễu lọc và đĩa đệm để tránh nước rỉ tràn ra rìa đáy phễu, mà không lọc qua màng lọc. Hút bằng máy chân không cho cạn hết nước. Sau khi lọc hết nước, cho bơm chạy không thêm khoảng 3 phút cho thật để tránh lan vi khuẩn ra bên ngoài giấy lọc khi nuôi ủ.
Cấy mẫu
Tháo phễu lọc và nhanh chóng dùng panh vơ trùng lấy màng lọc đã lọc, đặt lên trên đĩa môi trường thạch Endo một cách vô trùng.
Ủ nuôi cấy
Đặt các đĩa đã cấy mẫu vào tủ ấm nuôi ở 35-37o
C trong 24h, có thể úp ngược các đĩa môi trường nuôi cấy trong tủ để tránh bay hơi làm khô môi trường.
Đọc kết quả
Đếm tất cả những khuẩn lạc đỏ hồng có ánh kim. Ánh kim có thể điển hình, phủ tồn bộ khuẩn lạc, hoặc chỉ trên đỉnh khuẩn lạc, hoặc chỉ ở rìa khuẩn lạc
Vơ trùng lại bộ phận đĩa đệm, panh và phễu lọc sau mỗi mẫu bằng cách luộc sôi khoảng 10 phút.