Chương 2 : THỰC NGHIỆM
2.3 Quy trình khảo sát khả năng tiệt trùng của vật liệu
2.3.1 Rửa và khử trùng dụng cụ
Dụng cụthủy tinh mới phải rửa thật sạch, sau đó ngâm 1 đêm trong dung dịch HCl hay H2SO4 1-2% rồi rửa nước thật kỹvà sấy khô. Đối với các dụng cụ thủy tinh có dính mỡ, vazơlin, dầu… trước khi rửa cần lấy một ít bơng tẩm etanol để lau cho sạch. Các vết mỡ, các vết hóa chất, mơi trường cịn dính lại trên các dụng cụ thủy tinh sẽ có ảnh hưởng xấu đến kết quả thí nghiệm. Các
dụng cụ sau khi đã sấy khô đem cất vào những nơi sạch sẽ, khi nào sửdụng mới bỏra khỏi bao.
Đối với các pipet trước hết dùng bông để làm sạch rồi cho nước chảy qua pipet kéo hết cặn có trong pipet ra. Pipet rửa xong ngâm vào dung dịch rửa một đêm, rồi rửa lại, để khô tựnhiên.
Các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật sau khi rửa sạch sấy khô phải được khử trùng cẩn thận bằng cách chiếu đèn UV trong 5-10 phút để khửtrùng.
Phễu lọc hút chân không dùng khi đặt mẫu nuối cấy vi sinh cần rửa sạch, khửtrùng cẩn thận bằng cách đốt bông tẩm cồn 90oChơ đều phía trong phễu.
2.3.2 Chuẩn bị mẫu nướcthử nghiệm
Quy trình khảo sát khả năng tiệt trùng của vật liệu được chia làm hai giai đoạn với hai mẫu nước thử nghiệm có chứa lượng coliform khác nhau:
- Giai đoạn 1: Thử nghiệm khả năng diệt khuẩn coliform với mẫu nước lấy tại nhà vệ sinh của Khoa Hóa – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Mẫu nước sau khi lấy về cần lọc bỏ cặn váng trên giấy lọc sau đó tiến hành khảo sát tổng số lượng coliform trong mẫu nước đầu với các mẫu khơng pha lỗng, pha loãng 10 lần, 100 lần.
- Giai đoạn 2: Thử nghiệm khả năng diệt khuẩn coliform với mẫu nước lấy tại sông Kim Ngưu – Hà Nội, khu vực sông này chứa rất nhiều nguồn thải từ các nhà máy và nước thải sinh hoạt của các hộ dân đổra từhai bên bờ sông.
Nước sông Kim Ngưu lấy về đemlọc bỏcặn váng trên giấy lọc thơ sau đó lọc qua giấy lọc băng xanh rồi đem đi phân tích coliformở đầu vào với các mẫu khơng pha lỗng, pha lỗng 10 lần, 100 lần.
2.3.3 Chuẩn bị môi trường thạchEndo
Đây là mơi trường dinh dưỡng thích hợp để định lượng coliform và E.coli trong nước và trong thực phẩm. Ngồi ra người ta cũng có thể định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí khi điều chỉnh pHổn định.
Thành phần cho 100ml thạch Endo: - 1g pepton - 1g cao thịt - 1g lactozơ - 0,5g NaCl - 1,5g Agar - 0,25g Na2SO3 - 0,02 ÷ 0,04g fucsin bazơ
Hịa tan trước fucsin bazơ trong 100ml nước cất, đun nhẹ trong cốc chịu nhiệt vì fucsin bazơ khó hịa tan hơn các chất cịn lại. Sau đó thêm hỗn hợp các chất cịn lại vào cốc, hịa tan hồn tồn thu được thạch Endo có màu vàng nhạt đến vàng đậm tùy thuộc vào lượng fucsin bazơ trong khoảng 0,02 ÷ 0,04g. Hỗn hợp thạch Endo được rót đều lên đĩa petri ngay khi cịn nóng với độ dày lớp thạch bằng khoảng ½ chiều cao đĩa petri. Sau đó các đĩa petri được chiếu đèn UV trong hộp kín để khửtrùng trong thời gian 15 phút.
2.3.4Định lượng coliform
2.3.4.1 Nguyên tắc
Nuôi cấy một lượng mẫu nhất định lên môi trường Endo. Mơi trường Endo có chứa natri sulfit và fucsin có khả năng ức chế vi sinh vật gram dương. Trong q trình phát triển trên mơi trường này, coliform lên men đường lactozơ tạo thành anđehit và axit, anđehit tác động đến phức chất fucsin-sulfit và giải
phóng fucsin, sau đó fucsin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến đỏ cánh sen, trịn, bờ đều, có ánh kim hoặc không.
2.3.4.2 Tiến hành
Chuẩn bị mẫu nước thử nghiệm và pha loãng mẫu 10 lần. Sử dụng các vật liệu đã tổng hợp được để diệt khuẩn các mẫu nước. Các mẫu nước đầu và mẫu nước sau khi diệt khuẩn đem ni cấy theo quy trình như sau:
Sửdụng bơm hút chân không và phễu lọc đã khử trùng và đặt màng lọc vi sinh lên phễu để cấy 50ml mẫu nước đã diệt khuẩn lên màng lọc. Đặt màng lọc vào đĩa petri đã có mơi trường thạch Endo sao cho mặt trước của màng ở phía trên. Ni cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ37oC trong 24±1 giờ.
2.3.4.3 Kết quả
Đếm số khuẩn lạc có màu hồng tới màu đỏ trong phạm vị màng lọc trên các đĩapetri và khẳng định mật độ coliform theo công thức đã nêu ở mục 1.3.3.