Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa
Tách chiết ADN thực vật bằng dung dịch đệm chứa CTAB là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền thực vật. Dựa trên quy trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994), nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau đã được xây dựng nhằm thu được kết quả tối ưu cho từng đối tượng thực vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng quy trình tách chiết ADN mẫu lá lúa như sau:
1. Nghiền khoảng 2g lá lúa trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, sau đó chuyển vào ống eppendorf 2ml.
2. Cho 800µl CTAB 2%( có bổ sung 0.5% Nabisulfite), trộn đều bằng vontex, ủ 65oC trong 10 phút.
3. Sau khi ủ, cho thêm 800 µl Chloroform: isoamyalcohol (24:1), lắc đều 20 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Hút chuyển dung dịch ở pha trên sang ống eppendorf mới. Thêm 470µl Isopropanol, lắc nhẹ, để lạnh -20oC trong khoảng 1-2 giờ.
6. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dung dịch trong ống, thu tủa, rửa bằng 800 µl Ethanol 70%. Đổ và để khô kết tủa ở nhiệt độ phịng.
7. Hồ tan tủa trong 100µl TE (ở 4oC, qua đêm).
8. Thêm 2µl Rnase (10mg/ml) ủ 37oC trong 30 phút, sau đó thêm 800 µl Chloroform: isoamyalcohol (24:1) lắc nhẹ cho dung dịch trộn đều
9. Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút
10. Hút phần dung dịch pha trên sang ống eppendorf 2ml mới. Thêm 400µl Ethanol lạnh (-20oC) và 1/10 thể tích Natri acetat 3M, lắc nhẹ nhàng và giữ ở -20oC trong 60 phút.
11. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút
12. Loại bỏ dung dịch trong ống và rửa tủa bằng Ethanol 70%, để khô.
13. Hồ tan tủa trong 100µl TE, sau đó bảo quản dung dịch ADN tổng số ở - 4oC. Sau khi tách chiết được ADN, các mẫu ADN tổng số lúa cùng với ADN nồng độ chuẩn (Lamda ADN 25ng/µl) được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,1% trong môi trường đệm TBE 0,5X, sau đó nhuộm trong dung dịch Ethidium Brommide 0,5ng/ml và scan trên máy Molecular Imager FX (BioRad Laboratories). Độ tinh sạch, nguyên vẹn của ADN được đánh giá qua hình ảnh điện di, nồng độ các mẫu ADN được xác định thông qua phương pháp so sánh cường độ quang bằng phần mềm QuantityOne (BioRad Laboratories) giữa các băng điện di mẫu ADN và Lamda ADN.