2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Từ bộ vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử phân lập tại 4 vườn Quốc gia Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo, chúng tôi tiến hành so sánh tính tương đồng cao nhất của đoạn gen 16S rRNA so với các chủng chuẩn của các loài trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/). Dựa trên số liệu so sánh, chúng tơi lựa chọn các chủng có trình tự gen 16S rRNA tương đồng cao nhất với các loài B. velezensis, B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, B. methylotrophicus và B. oryzicola. Từ ống lưu giữ lạnh sâu ở -70oC, các chủng vi khuẩn lựa chọn được ria hoạt hóa trên môi trường thạch NA và được nuôi cấy ở 30oC. Sau 24 giờ, tế bào hoạt hóa thu được sẽ dùng cho các thử nghiệm mô tả ở phần dưới.
Bên cạnh đó, chúng tơi cũng sử dụng các chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh thực vật đang lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Các chủng đó bao gồm nấm
Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani và Phytophthora capsici; vi khuẩn Xanthomonas oryzae. Ngoài ra, chúng tôi cũng sử dụng một số
loài nấm kiểm định khác nữa là Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Saccharomyces cerevisiae.
2.1.2. Môi trường nghiên cứu
Trong quá trình thực hiện luận văn, chúng tôi đã sử dụng các môi trường ni cấy chính sau đây:
Mơi trường thạch NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp; g/L) Cao bò 3 g
Peptone 5 g Thạch 15 g
Nước cất 1000 ml pH 6,5 ± 0,2
Hịa đều 23 g mơi trường vào 1000 ml nước cất trong bình Duran. Hấp vơ trùng môi trường ở 121oC trong 21 phút. Chia đều ra các đĩa Petri.
Môi trường thạch PDA (g/L)
Khoai tây 200 g Dextrose 20 g Thạch 15 g Nước cất 1000 ml pH 6,5 ± 0,2
Cắt lắt 200 g khoai tây rồi đun nhẹ lửa trong 20 phút để chiết chất dinh dưỡng ra nước, bổ sung đường và thạch theo công thức trên. Hấp vô trùng môi trường ở 121oC trong 21 phút. Chia đều ra các đĩa Petri.
Môi trường dịch thể TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp; g/L) Casein thủy phân 15 g
Đậu tương thủy phân 5 g NaCl 5 g Nước cất 1000 ml pH 6,5 ± 0,2
Hòa đều 25 g môi trường vào 1000 ml nước cất. Chia đều 100 ml vào bình tam giác 250 ml. Hấp vô trùng môi trường ở 121oC trong 21 phút. Nếu là mơi trường thạch thì bổ sung thêm 15 g thạch/L trước khi đem đi vô trùng.
Môi trường dịch thể PVK (g/L)
Glucose 10 g Ca3(PO4)2 5 g KCl 0,2 g (NH4)2SO4 0,5 g
NaCl 0,2 g MgSO4. 7H2O 0,1 g MnSO4. H2O 0,002 g FeSO4. 7H2O 0,002 g
Hịa lần lượt các khống chất vào 1000 ml nước cất. Chia đều 100 ml vào bình tam giác 250 ml. Hấp vơ trùng môi trường ở 121oC trong 21 phút.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
Từ các tế bào đã hoạt hóa, các chủng vi khuẩn được cấy trải đều trên mặt thạch TSBA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) và được ủ ở 30oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn sinh trưởng trên bề mặt thạch sẽ tiết các chất có hoạt tính sinh học vào trong mơi trường thạch. Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán thạch. Theo đó, khoanh thạch được đục bằng ống nhựa vô trùng (Ø = 6 mm) và được đặt lên môi trường PDA (g/L: khoai tây) đã cấy sẵn các loài nấm kiểm định gây bệnh thực vật là Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani và Phytophthora capsici hoặc đặt lên môi trường
NA đã cấy vi khuẩn kiểm định gây bệnh thực vật là Xanthomonas oryzae. Ngoài ra, phổ hoạt tính kháng nấm cũng được kiểm tra trên các chủng nấm kiểm định là
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Saccharomyces cerevisiae.
2.2.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào
Từ các tế bào đã hoạt hóa, chủng vi khuẩn được cấy vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp) dịch thể. Sau 48 giờ nuôi cấy lắc 160 v/p ở 30oC, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn. Khả năng sinh enzyme ngoại bào được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch. Theo đó, dịch ni cấy vi khuẩn được nhỏ vào các giếng (Ø = 6 mm) đã đục lỗ trong đĩa thạch chứa 0,1% các loại cơ chất là tinh bột tan, CMC, xylan, chitin, casein và tributyrin. Sau 24 giờ ủ đĩa thạch cơ chất ở 37oC, hoạt tính amylase và CMCase được xác định dựa trên vòng trong phân
giải cơ chất tinh bột tan và CMC xung quanh khoanh thạch khi nhuộm với dung dịch lugo; hoạt tính xylanase và chitinase được quan sát khi nhuộm cơ chất xylan và chitin với dung dịch đỏ cơng gơ; hoạt tính protease và lipase được quan sát trực tiếp trên cơ chất casein và tributyrin.
2.2.3. Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan
Từ các tế bào đã được hoạt hóa, chủng vi khuẩn được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch thể. Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ở 30oC, dịch nuôi cấy vi khuẩn được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào. Hàm lượng phosphate vô cơ giải phóng từ Ca3(PO4)2 vào mơi trường ni cấy được xác định bằng phương pháp xanh molybdenum như Holman et al. (1943) mô tả dựa trên đường chuẩn phosphate xây dựng từ KH2PO4.
2.2.4. Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA
Chủng vi khuẩn hoạt hóa được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml mơi trường dịch thể NA có bổ sung với L-tryptophan (Merck, Đức) có nồng độ cuối là 5 mM. Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ở 30oC, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm ở 8,000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic acid (IAA) được xác định dựa trên phản ứng tạo mầu với thuốc thử Salkowski [17]. Hàm lượng IAA sinh ra được xác định dựa trên đường chuẩn xây dựng từ IAA (Merck, Đức).
2.2.5. Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen
Từ các khuẩn lạc thuần khiết, ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp của [16]. Mức độ tinh sạch của ADN được kiểm tra dựa trên chỉ số bước sóng A260/A280 (xấp xỉ 1,8). Sau đó, 50 ng ADN của từng chủng vi khuẩn được đưa vào ống PCR có thể tích phản ứng cuối cùng là 25 µl chuẩn bị từ DreamTaqTM
PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Mỹ). Phản ứng PCR được thực hiện với mồi ERIC và GTG5 theo chu trình nhiệt Freitas và cộng sự (2008) đã mô tả [15]. Sản phẩm PCR được điện di trong 2 giờ tại 65 V trên bản gel agarose 2% có bổ sung với chất nhuộm ADN RedSafe (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc). Hình ảnh điện di
được chụp lại trên hệ thống soi gel (BioRad, Mỹ). Mơ hình băng ADN (hay kiểu gen) tạo ra từ mỗi chủng vi khuẩn được phân tích và được mã hóa sang hệ ma trận nhị phân 1/0. Tính tương đồng về kiểu gen được tính tốn theo hệ số Dice. Mối quan hệ về kiểu gen của các chủng được thể hiện theo sơ đồ cây sử dụng thuật toán UPGMA. Tất cả các bước phân tích tính tương đồng kiểu gen được thực hiện trên phần mềm NTSYSpc 2.1.
2.2.6. Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox- amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) và 16S rRNA được thực hiện với các cặp mồi theo mô tả của Rooney và công sự (2009) [40]. Trình tự của 6 gen được gửi lên ngân hàng gen với các số hiệu lần lượt là KU904810, KU904811, KU904812 KU904813, KU904814 và KU904810. Trình tự đa gen của chủng vi khuẩn nghiên cứu có chiều dài 5.547 bp được kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp của gen gyrA, đoạn 964 bp của gen rpoB, đoạn 875 bp của gen purH, đoạn 777 bp của gen polC, đoạn
835 bp của gen groEL và đoạn 1,168 bp của gen 16S rRNA. Trình tự đa gen của các loài quan hệ gần gũi trong nghiên cứu của Kubo và cộng sự (2011) được tải về từ ngân hàng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [29]. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1,000 lần trên phần mềm MEGA phiên bản 5.05.
2.2.7. Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn
Từ dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào, chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tách chiết bằng 4 phương pháp là sử dụng dung môi hữu cơ, hấp phụ với hạt amberlite-XAD7, đông khô dịch nuôi cấy kèm tách chiết bằng ethanol và tủa ở pH thấp. Các phương pháp tách chiết được lặp lại 2 đến 3 lần theo quy trình như sau:
i. Phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ: dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào được lần lượt đưa vào các dung mơi có độ phân cực khác nhau là
benzen, 1-butanol, chloroform, ethyl acetate, hexan, 2-pentanol và tuluene theo tỷ lệ 1 : 1. Sau khi đảo trộn mẫu trong 10 phút, hỗn hợp dung dịch được ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 20 phút nhằm tách rõ 2 lớp dịch nuôi cấy và dung mơi. Phần dung mơi phía trên được thu lại và cơ quay ở nhiệt độ 60oC. Sau đó, cặn kháng sinh thơ được hồn nguyên với nước cất và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
ii. Phương pháp hấp phụ với hạt amberlite-XAD7: hạt amberlite-XAD7 được đưa vào dịch nuôi cấy theo tỷ lệ 1 : 5. Hỗn hợp này được khuấy nhẹ qua đêm trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 4oC. Sau đó, hạt amberlite được thu lại và rửa liên tiếp 3 lần với nước cất, 1 lần với ethanol 30%. Hạt amberlite được khuấy nhẹ với ethanol 75% trong 4 giờ. Chất kháng sinh thô thôi ra trong ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt độ 60oC. Sau đó, cặn kháng sinh thơ được hoàn nguyên với nước cất và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
iii. Phương pháp đơng khơ: tiến hành đơng khơ hồn tồn dịch ni cấy. Sau đó, đưa một lượng thể tích ethanol 100% tương đương với lượng mẫu ban đầu vào cặn đông khô và lắc ở 160 vòng/phút trong 2 giờ nhằm chiết rút chất kháng sinh thô. Phần ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt độ 60oC. Sau đó, cặn kháng sinh thơ được hồn ngun với nước cất và được thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
iv. Phương pháp tủa ở pH thấp: dịch nuôi cấy được chỉnh về pH 3,0 sử dụng HCl 6N và được ủ qua đêm ở 4oC. Sau đó, dịch ni cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút. Phần cặn tủa được thu lại và hoàn nguyên với nước cất. Hoạt tính kháng sinh thô trong cặn tủa được thử với nấm và vi khuẩn kiểm định.
2.2.8. Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn
Chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tinh sạch bằng kỹ thuật HPLC sử dụng cột Zorbax Eclipse XDB - C18 (4,6 ì 250 mm, 5 àl, Agilent Technologies, USA). Phương pháp tinh sạch HPLC được thực hiện theo mô tả của He và cộng sự
(2007) [23]. Theo đó, pha động sử dụng methanol và nước chứa 0,05% trifluoroacetic acid. Sau khi cân bằng cột với tỷ lệ 20% methanol, 30 µl dịch kháng sinh tách chiết theo 2 bước bằng dung môi 1 - butanol và hạt amberlite-XAD7 được tải lên cột. Dung mơi hệ động được thay đổi tuyến tính theo nồng độ methanol từ 20% lên 40% trong 10 phút, từ 40% lên 60% trong 5 phút và từ 60% lên 70% trong 10 phút. Tốc độ dòng của cả quá trình sắc ký là 0,5 ml/phút. Sắc ký đồ được ghi nhận tại bước sóng 220 nm. Sau khi bị thơi ra khỏi cột, các phân đoạn sắc ký (0,5 ml/phân đoạn) được thu nhận, cơ quay loại bỏ dung mơi và thử hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn. Sau đó, các phân đoạn có hoạt tính được trộn lại với nhau và được tinh sạch lại một lần nữa theo chu trình sắc ký mơ tả như trên. Phân đoạn có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được gửi sang Trung tâm các Phương pháp Phổ Ứng dụng - Viện Hóa Học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ để xác định phổ khối (MS).
2.2.9. Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuẩn
Khả năng bền nhiệt độ, bền pH và bền với các enzyme thủy phân của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được thử nghiệm như sau:
i. Khả năng bền nhiệt: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ở các nhiệt độ 60o
C, 80oC và 100oC. Sau thời gian xử lý là 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tả ở trên.
ii. Khả năng bền pH: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ở các pH từ 3,0 đến 7,0 trong đệm citrate-phosphate và pH 8,0 đến 9,0 trong đệm Tris-HCl. Sau 24 giờ ủ ở 4oC, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tả ở trên.
iii. Khả năng bền với các enzyme thủy phân: 5 enzyme là trypsin, α- chymotrypsin, amylase, lipase và proteinase K được pha trong đệm phosphate 25 mM (pH 7,0) tới nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml. Sau đó, dịch tách chiết chất kháng sinh được lần lượt trộn đều với các dung dịch enzyme
theo tỷ lệ 1 : 1 và được ủ ở 37oC. Sau 2 giờ xử lý, hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tả ở trên.
2.2.10. Thử nghiệm tính an tồn của chất kháng nấm và kháng khuẩn
Tính an tồn của chất kháng nấm và kháng khuẩn sản sinh từ chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604 bước đầu được thử nghiệm trên khả
năng nảy mầm của hạt thóc, hạt lạc và hạt ngơ; và thử nghiệm khả năng sinh trưởng của các loại cây lúa, cây lạc và cây ngơ. Qua đó, chất kháng nấm tách thơ được pha lỗng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng nước cất và các loại hạt kể trên được ngâm trong 3 giờ trong dung dịch pha lỗng này. Sau đó, hạt được đưa lên lớp bông ẩm nhằm tạo điều kiện thuận lợi nẩy mầm ở 25oC. Độ ẩm của bông được kiểm tra hàng ngày và kích thước (cm) hạt nẩy mầm được đo lại sau 4 đến 6 ngày ủ mầm. Đối chứng là các hạt ngâm trong nước cất trước khi ủ mầm.
Nhằm đánh giá tính an tồn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn lên sự sinh trưởng của cây non, mầm hạt cây tại các mẫu đối chứng được trồng ra đất. Sau 5 - 7 ngày khi cây đã phát triển ổn định, chất kháng nấm tách thơ được pha lỗng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được phun đều lên bề mặt các lá. Đối chứng là nước cất phun đều lên bề mặt lá. Màu sắc lá được quan sát hàng ngày. Sau 5 ngày thử nghiệm, kích thước lá 1 và 2 được ghi lại và so sánh.
3. Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng nghiên cứu tính sinh học của chủng nghiên cứu
3.1.1. B. amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác
nhau của Việt Nam
Từ tháng 11 năm 2012 đến tháng 10 năm 2013, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành thu thập 79 mẫu đất tại 4 vườn Quốc gia và các vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận là Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo. 1.441 chủng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử đã được phân lập bằng phương pháp xử lý nhiệt [45]. Dựa trên các đặc điểm khác biệt về màu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài khuẩn lạc, 252 (17,5%) chủng đã được giải trình tự gen 16S rRNA (xấp xỉ 1.500 bp). So sánh trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e cho thấy, 14 chủng có chỉ số tương đồng gen 16S rRNA cao nhất với chủng B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum FZB42 là 99,93%. Gen 16S rRNA của 14 chủng này đều tương
đồng nhau và chỉ sai khác 1 nucleotide ở vị trí 583 (G thay bằng A) so với chủng chuẩn FZB42. Khơng có chủng nào có trình tự gen 16S rRNA tương đồng cao nhất