STT Thành phần Thể tích (l) 1 Sản phẩm PCR 2 2 Đệm T4 DNA ligase 2X 5 3 T4 DNA ligase 1 4 Vector pGEM-T 1 5 ddH2O 1 Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 3 tiếng, sau đó sử dụng cho biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α
Tế bào khả biến E. coli DH5 được lấy ra từ tủ lạnh sâu -80oC để trên đá 10 phút cho tan dần, sau đó được bổ sung hỗn hợp phản ứng gắn ở trên, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào. Hỗn hợp biến nạp được làm sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, làm lạnh trên đá 2 phút rồi bổ sung 500 l
94oC-40 giây 53oC-30 giây 72oC-30 giây 40 chu kỳ
môi trường LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp. Các tế bào sau biến nạp được giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và tiếp đến nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút ở 37o
C trong 60 phút. 50-100 l hỗn hợp biến nạp được cấy trải trên đĩa LB đặc có chứa ampicillin g /ml, cơ chất X-gal 20 mg/ml và chất cảm ứng IPTG 0,1 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm. Các thể biến nạp được sơ bộ nhân ra bằng màu sắc của khuẩn lạc và được kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng PCR và xác định trình tự gen.
2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phƣơng pháp Sanger
Plasmid từ các thể biến nạp được tách và tinh sạch bằng kit của Hãng Fermentas như được mô tả ở mục 2.2.2 và được sử dụng để xác định trình tự đoạn gen đích.
Nguyên tắc: Xác định trình tự dựa trên phương pháp kết thúc kéo dài chuỗi
nhờ dideoxyribonucleotide của Sanger và tập thể [31]. Các ddNTP do khơng chứa nhóm –OH tại vị trí 2’ của gốc đường nên khi được enzyme DNA polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ khơng thể tham gia hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide mới và khiến cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại. Như vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới được đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện di acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đưa ra trình tự đoạn DNA gốc.
Quy trình tiến hành: Khuôn cho phản ứng PCR được chuẩn bị để xác định
trình tự, sản phẩm PCR đoạn gen mã hoá cho protease HIV-1 được pha lỗng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol).
Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm: 6 l hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 l khuôn, 1 l mồi (mồi xuôi
hoặc mồi ngược), H2O vô trùng vừa đủ 20 l.
Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ gồm 3 bước: 96oC trong 30 giây, 56oC trong 30 giây, 60oC trong 4 phút. Sản phẩm của phản ứng PCR này được xử lý trước khi đưa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bước sau:
- Dung dịch dừng phản ứng gồm: 20 l CH3COOK 3 M pH 5,2, 20 l EDTA 100 mM pH 8, 10 l glycogen và trộn đều. 5 l dung dịch dừng phản ứng được bổ
sung vào 1 phản ứng PCR 20 l và trộn đều.
- Bổ sung vào hỗn hợp 60 l ethanol 95% giữ ở -20oC. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Dịch nổi được hút bỏ và thu kết tủa. Kết tủa được rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% giữ ở - 20oC và được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được hút bỏ cẩn thận bằng pipet, kết tủa được để khơ ở nhiệt độ phịng sau đó được hồ tan trở lại bằng 40 l dung dịch SLS (sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý được giải
trình tự bằng hệ thống đọc trình tự CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter .
2.2.7. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli
Để gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện pET32a, cả plamid tái tổ hợp pGEM-Prot và vector pET32a đều được cắt bằng hai enzyme
BamHI và XhoI để tạo các đầu dính, thành phần phản ứng cắt được nêu ở bảng 3,
thời gian phản ứng là 3h giờ, ở 37oC.