2.1.2 .Các hệ vector và chủng vi sinh vật
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.10. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western
blotting)
Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa protease HIV-1 (kháng nguyên)
và kháng thể đơn dòng kháng protease. Phức hợp protease-kháng thể tiếp tục được nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợp proteasse- kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp được phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển từ khơng màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường.
Các bước tiến hành:
Protein sau khi được tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, được chuyển lên màng PVDF bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có chứa 10% methanol. Trong q trình điện chuyển, vị trí các băng protein được giữ nguyên.
Màng được cố định bằng dung dịch BSA 1% trong đệm Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 qua đêm ở 4oC hoặc bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Màng được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1% để loại bỏ BSA thừa.
Màng sau đó được ủ với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (kháng thể sơ cấp), lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC.
Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng được loại bỏ bằng cách tráng rửa màng 3 lần trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Sau đó màng được ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatase kiềm. Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng được loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%.
Các băng protein được hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p- nitro blue tetrazolium chloride và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5 có MgCl2 5 mM và NaCl 0,1 M. Phản ứng được làm ngừng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có chứa EDTA 20 mM, pH 8,0 khi các băng protein hiện rõ.
2.2.11. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phƣơng pháp của Richard và tâ ̣p thể [31]
Nguyên tắc của phương pháp : Protease HIV-1 chỉ nhận ra và phân cắt tại vị
trí đặc hiệu nếu cơ chất có chứa bất kì một trong 7 liên kết của trình tự tương ứng trên polyprotein gag của virus. Bằng cách tổng hợp một cơ chất Lys-Ala-Arg-Val- Leu*Nph-Glu-Ala-Met có chứa vị trí phân cắt đặc hiệu của protease HIV-1 với sự có mặt của nhóm 4-NO2- phenylalanine (Nph) thay cho phenylalanine, cơ chất có khả năng hấp phụ ở bước sóng 300 nm. Dưới tác dụng hoạt tính phân cắt của protease, liên kết bị phân giải cho độ giảm hấp phụ ở bước sóng 300 nm trên máy quang phổ kế [9, 29].
Tiến hành: Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 5. Hỗn hợp phản
ứng được trộn đều, đo ở bước sóng 300 nm trong 10 phút trên hệ thống máy quang phổ khả biến DU800 của hãng Beckman Coulter.
Bảng 5. Thành phần của phản ứng hoạt tính protease HIV-1
Thành phần Thể tích (μl) dd H2O khử ion, khử trùng 136
Đệm 2x 150 Cơ chất tổng hợp đặc hiệu 12
Protease HIV-1 tái tổ hợp 2 Tổng thể tích 300
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1
Trong một nghiên cứu trước đây, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [3] đã tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa cho protease của HIV đã sử dụng kỹ thuật PCR lồng với hai cặp mồi HIV Fw1/Rv1 (cặp mồi ngoài) và HIV FW2/RV2 (cặp mồi trong). Trong nghiên cứu này, các tác giả (chúng tôi là đồng tác giả) đã nhân bản thành cơng đoạn gen kích thước khoảng 0,34 kb mã hóa cho protease HIV từ 8 trong số 50 bệnh nhân được bệnh viện xác nhận là nhiễm HIV-1. Trong số 8 mẫu dương tính này chỉ có 2 bệnh nhân thuộc nhóm đã và đang điều trị thuốc kháng virus (trong đó có thuốc ức chế protease-PI). Đoạn gen cũng đã được nhóm tác giả nhân dịng và lưu giữ trong vector pCR2.1 dưới dạng pCR2.1-Prot. Vì vậy chúng tơi đã chọn vector pCR2.1-Prot mang đoạn gen của 01 bệnh nhân điều trị thuốc kháng virus ký hiệu là 02VN.HN27510 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trước hết, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen thu được sau đó được so sánh với trình tự của đoạn gen tương ứng của HIV thuộc phân nhóm CRF01_AE, mã số EU518273 của Trung Quốc [41].
Kết quả giải trình tự (hình 4) cho thấy đoạn gen mã hóa protease HIV-1 từ vector tái tổ hợp pCR2.1-Prot có độ tương đồng 96% so với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE mã số EU518273 của Trung Quốc. Các vị trị có sự sai khác về trình tự nucleotide so với trình tự EU518273 trên Ngân hàng gen là: A6G, A37G, A43G, T105A, A120G, G225A, A248C, T282C, T285C, C297T. Trình tự gen này đã được chúng tơi đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tế với số hiệu HQ890881.
Hình 4: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 so với trình tự đoạn gen tƣơng ứng EU518273 của Trung Quốc
3.1.2. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 (Đột biến N83T) biến N83T)
Chúng tôi đã sử dụng phần mềm Genetyx để dịch trình tự nucleotide của gen mã hóa proteaase thành trình tự axit amin và so sánh trình tự axit amin suy diễn thu được với trình tự axit amin được suy ra từ trình tự gen EU518273 (hình 5) và thấy rằng trình tự axit amin của mẫu virus trong nghiên cứu của chúng tơi có độ tương đồng 96 % so với trình tự axit amin của đối chứng. Các vị trí thay đổi về axit amin là I13V, I15V, D36E, N83T. Đặc biệt, đối chiếu trình tự axit amin của protease với ngân hàng dữ liệu HIV quốc tế cho thấy sự thay thế axit amin Asn ở vị trí 83 bằng Thr (N83T) là một đột biến bất thường và có tính kháng nhẹ thuốc PI (hình 6). Những bệnh nhân nặng được điều trị PI hay xảy ra đột biến N83D với sự thay thế N bằng D ở vị trí axit amin 83 [42]. Trong trường hợp bệnh nhân 02VN.HN27510, đột
biến N83T là loại đột biến lần đầu tiên được tìm thấy trong gen mã hóa của protease HIV-1.
Hình 5: So sánh trình tự axit amin của protease HIV-1 thu nhận ở Việt Nam (HQ890881) so với trình tự của EU518273 trong Ngân hàng Gen quốc tế.
Hình 6: Kiểm tra đột biến trong của protease HIV-1 thu nhận ở Việt Nam (HQ890881) so với cơ sở dữ liệu HIV của Đại học Stanford
3.2. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vector pET32a biến N83T trong vector pET32a
Việc thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T được dựa trên cơ sở kết quả biểu hiện gen protease HIV-1 của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể (dẫn liệu chưa công bố). Cụ thể là đoạn gen mã hóa cho protease HIV mang đột biến kháng thuốc N83T được đưa vào vector pET32a dưới dạng protein dung hợp như được mơ tả ở hình 7. Trong đó thioredoxin và đi his- tag là của vector pET32a, cịn trình tự nhận biết và phân cắt của protease HIV-1, đoạn HA mã hóa cho epitope của kháng nguyên vỏ hemagglutinin (HA) của virus cúm tại đầu C của protease HIV -1 là do chúng tôi dự kiến thiết kế để đưa vào cùng với gen mã hóa cho protease HIV-1. HA có ái lực rất mạnh với gel protein G- sepharose hay gel anti-HA-agarose, nhờ đó sẽ giúp tăng khả năng tinh sạch protease tái tổ hợp. Epitope của HA bao gồm 9 axit amin là YPYDVPDYA, kích thước nhỏ nên thường khơng ảnh hưởng đến đặc tính của protein đích.
Theo cách thiết kế này, nếu gen mã hóa cho protease HIV-1 được biểu hiện và khơng có hoạt tính tự cắt của protease HIV-1 tại liên kết Phe-Pro thì protein tái tổ hợp được tạo thành sẽ dung hợp thioredoxin tại đầu N, có đi HA và His-tag, với tổng số 282 gốc axit amin với khối lượng phân tử khoảng 31 kDa. Ngược lại, nếu protein tái tổ hợp tự cắt tại vị trí đặc hiệu của protease HIV-1 thì sẽ tạo ra protease HIV-1 tái tổ hợp gắn đuôi HA và His-tag với KLPT khoảng 12 kDa.
Hình 7: Sơ đồ cấu trúc protein dung hợp với protease HIV-1 để biểu hiện trong vector pET32a
3.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc N83T
Để tạo được hệ thống vector biểu hiện gen mã hóa protease mang đột biến kháng thuốc N83T, chúng tơi buộc phải nhân bản lại đoạn gen đã có trong vector pCR2.1-Prot bằng PCR để đưa thêm các trình tự mong muốn vào hai đầu của gen.
Chúng tơi sử dụng cặp mồi HIV-Fw1 và HIV-Rv3 có trình tự như sau:
HIV-FW1: 5’-GGGCGGATCCACTAGT BamHI SpeI GGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGC-3’ Gen gag HIV-RV3: 5’-AGTCCTCGAGAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAAAATTTA XhoI HA (Hemagglutinin) AAGTGCAGCCAATCTG-3’
PCR được thực hiện với các điều kiện phản ứng nêu trong mục 2.2.4, sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 2%. Kết quả thu được (hình 8) cho thấy chúng tôi đã thu được một băng DNA có kích thước khoảng 0,34 kb đúng với tính tốn lý thuyết (đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 dài 297 bp của gen mã hóa protease và 21 nucleotide của phần mồi được thiết kế gắn thêm trình tự tự cắt của protease HIV-1, 27 nucleotide của HA cùng với vị trí cắt enzyme giới hạn). Mẫu đối chứng âm (hình 4, đường chạy 2) khơng cho băng DNA nào. Như vậy, sơ bộ có thể kết luận rằng chúng tơi đã nhân bản thành cơng đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng cặp mồi HIV Fw1/Rv3.
Hình 8: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen của protease HIV
Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 100 bp
Đường chạy 2: Đối chứng âm (khơng có khn DNA)
Đường chạy 3: Sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa protease HIV-1
3.2.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5 bào E. coli chủng DH5
Tiếp theo, sản phẩm PCR ở bước thí nghiệm trước được nhân dòng vào vector pGEM-T theo kit của hãng Promega. Phản ứng gắn giữa sản phẩm PCR và vector pGEM-T được thực hiện để tạo vector pGEM- T tái tổ hợp mang đoạn gen mã hoá protease HIV-1 mong muốn. Sản phẩm này sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ
hợp được nhân lên với số lượng lớn.
Kết quả biến nạp (hình 9) cho thấy, chúng tôi đã thu nhận được hầu hết các khuẩn lạc trắng và một số khuẩn lạc xanh trên mơi trường LB có bổ sung kháng
Theo lý thuyết, các khuẩn lạc E. coli màu trắng sẽ chứa plasmid tái tổ hợp, trong khi đó các khuẩn lạc xanh mang plasmid tự đóng vịng, khơng chứa gen ngoại lai. Kết quả này cho phép chúng tôi bước đầu kết luận là đã thu nhận được khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa protease HIV-1.
Hình 9: Kết quả biến nạp hỗn hợp gắn giữa sản phẩm PCR (đoạn gen mã hóa protease HIV-1) và vector pGEM-T Easy vào E. coli chủng DH5α
Từ các khuẩn lạc thu được, một số khuẩn lạc trắng được chọn ngẫu nhiên để tiến hành tinh sạch plasmid. Để kiểm tra plasmid đã tinh sạch có chứa đoạn gen mã hố protease HIV-1 hay khơng chúng tôi đã sử dụng plasmid này làm khuôn và tiến hành PCR sử dụng cặp mồi pGEM-T Fw/Rv (cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide ở hai đầu của trình tự vùng nhân dịng đa điểm cắt của vector pGEM-T). Theo tính tốn, nếu chúng tơi nhân dịng khơng thành cơng thì khi PCR dùng cặp mồi pGEM-T Fw/Rv sẽ nhân lên được đoạn DNA có kích thước khoảng 0,3 kb còn trong trường hợp nhân dòng thành cơng thì PCR sẽ nhân được đoạn DNA có kích thước 0,64 kb bao gồm kích thước 0,34 kb của đoạn gen mã hóa protease HIV-1 gắn vào và 0,3 kb của đoạn DNA plasmid.
Hình 10: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của mang gen mã hóa protease HIV-1 trong plasmid tái tổ hợp
Đường chạy 1-3: Sản phầm PCR plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng Đường chạy 4: Đối chứng âm (khơng có khn DNA)
Đường chạy 5: Thang chuẩn DNA 1Kb
Đường chạy 6: Sản phẩm PCR khuẩn lạc xanh
Kết quả điện di sản phẩm PCR thu được ở hình 10 cho thấy sản phẩm PCR với khn là plasmid tinh sạch từ khuẩn lạc trắng cho băng DNA nhân bản kích thước khoảng 0,64 kb như tính tốn lý thuyết (hình 10, đường chạy 1-3). Trong khi đối chứng âm khơng có DNA (hình 10, đường chạy 4) khơng cho băng nhân bản nào. Như vậy, chúng tơi có thể khẳng định plasmid tinh sạch được có chứa đoạn gen mã hoá protease HIV-1 mong muốn và được ký hiệu là pGEM-ProtHA.
Để một lần nữa khẳng định gen mã hoá protease HIV-1 đã được nhân dịng vào vector pGEM-T, chúng tơi tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong plasmid
của đoạn gen mã hóa protease trong vector pCR2.1-Prot. Kết quả (khơng nêu ở đây) khẳng định phần gen mã hóa cho protease có trình tự trùng khớp 100% với đoạn gen này trong vector pCR2.1-Prot.
3.2.3. Đƣa gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc vào vector pET32a
Vector pET32a (sơ đồ cấu tạo ở hình 11) được dùng để biểu hiện protease HIV-1 mang đột biến N83T. Đây là vector có kích thước 5,9 kb, chứa trình tự đa điểm cắt, mang promoter mạnh của thực khuẩn thể T7 thuận tiện cho biểu hiện nhiều loại protein tái tổ hợp khác nhau. Đồng thời pET32a cịn có protein dung hợp Thioredoxin (TRX) ở đầu N làm tăng độ hòa tan của protease HIV-1 và 6 gốc His ở đầu cuối C ngay trước mã kết thúc rất thuận tiện cho quá trình tinh sạch.
Sau khi nhân dịng thành cơng đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T gắn thêm trình tự HA vào vector pGEM-T, chúng tôi tiến hành xử lý vector pGEM-ProtHA và vector pET32a bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và XhoI nhằm tạo các đầu dính tương thích cho phản ứng gắn sau này. Sản phẩm cắt enzyme giới hạn sau đó được tinh sạch. Kết quả điện di gel agarose 1% sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA sau tinh sạch (hình 12) cho thấy chúng tôi đã thu được 2 băng DNA rõ nét, một băng có kích thước khoảng 5,9 kb tương ứng với kích thước vector pET32a (hình 12, đường chạy 3) và một băng có kích thước khoảng 0,34 kb tương ứng với kích thước của gen mã hóa protease HIV-1 (hình 12, đường chạy 1).
Hình 12: Điện di sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA bằng BamHI và XhoI
Đường chạy 1: Gen mã hóa protease HIV-1 sau khi được xử lý bằng BamHI và XhoI Đường chạy 2: Thang chuẩn DNA 1 kb
Đường chạy 3: Vector pET32a sau khi được xử lý bằng BamHI và XhoI
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng gắn đoạn gen mã hóa protease HIV- 1 vào vector pET32a bằng enzym T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 4oC qua đêm (12-16 giờ), sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và cấy trải trên đĩa LB có bổ sung 50 g/ml ampicillin và 34 g/ml cholramphenicol, nuôi
được chọn ngẫu nhiên để xác định sự có mặt của gen trong vector bằng phương pháp PCR trực tiếp với hai cặp mồi T7 promoter/teminator (gọi tắt là cặp mồi T7Fw/Rv) có trình tự dựa trên trình tự của vector pET32a. Một phản ứng với với khuôn là pET32a nguyên bản không chứa đoạn gen mã hóa protease HIV-1 cũng được tiến hành để làm đối chứng. Theo tính tốn lý thuyết, các khuẩn lạc có chứa vector pET32a-ProtHA tái tổ hợp, khi PCR sử dụng cặp mồi T7 sẽ cho băng DNA kích thước khoảng 1,1 kb bao gồm 0,34 kb của đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và đoạn 0,74 kb của vector. Cịn phản ứng với khn là pET32a nguyên bản, khi PCR sử dụng cặp mồi này sẽ chỉ cho băng DNA kích thước khoảng 0,74 kb.
Hình 13: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1