Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và với cellulose (khơng nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết [10].
1.3.2. Công nghệ sản xuất ethanol từ nguyên liệu Lignocellulose
Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Tuy nhiên, sự phát triển của nó đang bị hạn chế bởi những khó khăn về mặt lợi nhuận kinh tế và kỹ thuật chưa thực sự tối ưu. Sơ đồ cơng nghệ q trình sản xuất ethanol nguyên liệu lignocellulose (Hình 10).
Hình 10: Quy trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose [12]
Bƣớc 1: Tiền xử lý
Bước tiền xử lý nguyên liệu nhằm tạo ra một dạng cellulose đơn giản để cho quá trình thủy phân dễ dàng hơn và các enzym lên men có thể tiếp xúc tối đa với cơ chất tương thích. Bước tiền xử lý là bắt buộc để q trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt. Có rất nhiều phương pháp được sử dụng cho tiền xử lý bao gồm các phương pháp hóa học, trong đó phương pháp xử lý bằng hơi nước kết hợp với axit/kiềm đang được sử dụng rộng rãi. Một số công nghệ tiền xử lý phổ biến:
Nguyên liệu Tiền xử lý Lên men Thủy phân Chưng cất Ethanol
Thủy phân và lên men đồng thời Tổ hợp enzyme thủy phân
Chủng nấm men lên men dịch đường hiệu quả
Cơ học Hóa học Sinh học
a. Các phương pháp tiền xử lý hóa học:
Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid lỗng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid. Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên vì nó rẻ và hiệu quả. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ q trình trung hịa acid với Ca(OH)2.
Với kiềm: đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến tiền xử lý lignocellulose với xút hoặc xút cùng các hóa chất khác. Tuy nhiên, dựa trên chi phí hóa chất, thì sữa vơi là hóa chất thích hợp.
Ngồi ra cịn có những phương pháp tiền xử lý như sử dụng dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2, NH3 … Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mơ phịng thí nghiệm.
b. Các phương pháp tiền xử lý cơ học:
Các phương pháp thuộc nhóm này khơng sử dụng hóa chất trong q trình xử lý. Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi.
Bƣớc 2: Thủy phân nguyên liệu.
Có thể nói, cơng đoạn chủ chốt và quyết định hiệu quả của quá trình sản xuất cồn từ nhiên liệu biomass là thủy phân nguyên liệu thành đường. Sự phát triển của kỹ thuật di truyền, các nhà nghiên cứu đang hướng đến việc tạo ra một tổ hợp enzyme có thể thủy phân nguyên liệu lignocellulose hiệu quả nhất.
Để có thể thủy phân nguồn lignocellulose cần có sự chuyển đổi các thành phần Cellulose, hemicellulose…thành các dạng đường đơn. Việc chuyển hóa này được thực hiện bởi các enzyme chuyên dụng để thủy phân lignocellulose.
- Chuyển đổi cellulose: Quá trình thủy phân bằng tổ hợp enzyme cellulose tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose.
- Chuyển đổi hemicellulose: Hemicellulose là một loại polymer dị hình được tạo bằng các đơn phân pentose, đơn phân hexose và các acid đường.
Hiện nay hướng tiếp cận vấn đề này là thủy phân nguyên liệu thông qua tiền xử lý axit, kiềm, nổ hơi phá vỡ cấu trúc, sau đó chuyển hóa sinh học nhờ enzyme thủy phân. Nguồn enzyme được sử dụng phổ biến là cellulase.
a. Ezyme cellulase và vi sinh vật phân hủy cellulose
Cellulase là những enzyme thủy phân cellulose, các enzyme này được tạo ra từ rất nhiều sinh vật khác nhau như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, thực vật và côn trùng. Trong sản xuất ethanol từ biomass, khả năng ứng dụng enzyme cụ thể nhất là thay thế công đoạn thủy phân nguyên liệu dùng axit bằng việc thủy phân dùng enzyme trước khi thực hiện công đoạn lên men.
b) Vi sinh vật phân hủy cellulose.
Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose rất đa dạng và phong phú. Nhiều loại nấm và vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí, ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Một số vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose như sau:
Hình 11: Một số vi sinh vật điển hình có khả năng sinh tổng hợp cellulase [11]
Nấm: Nấm mốc (nấm sợi) là nhóm có khả năng tiết ra ngồi mơi trường một lượng
lớn enzyme cellulase có cấu trúc hồn chỉnh, đầy đủ các thành phần nên có thể phân giải cellulose mạnh và triệt để. Có nhiều loại nấm mốc có khả năng tạo cellulase, trong đó nấm mốc Trichoderma reesei được quan tâm nhiều hơn cả do có khả năng sinh tổng hợp một loạt các enzyme phân hủy lignocellulose thành đường đơn và các sản phẩm trung gian khác. Ngồi ra, có một số loại nấm khác cũng có khả năng
phân giải cellulose khá cao như: Aspergillus niger, Aspergillus wenttii, Penicillium
inophinum, Sporotrichum pulverulentum..[11].
Vi khuẩn: Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose mạnh
nhưng cường độ không bằng nấm do enzyme tiết ra môi trường ít hơn và thành phần không đầy đủ. Nhiều nghiên cứu vẫn đang được tiến hành đối với việc sản xuất cellulase từ vi khuẩn. Các vi khuẩn này có khả năng phân hủy cellulose cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Nhóm kỵ khí điển hình bao gồm các giống acetivibrio, bacteroides, clostridium, micromonospora và ruminococcus. Nhóm hiếu khí bao gồm các giống Acidothermus, Bacillus, cellulomonas, cellvibrio, cytophaga, Microbispora, Pseudomonas và Thermomonospora.
c. Các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân.
+ Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu
Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn công của các tác nhân thủy phân, ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết. Cấu trúc của nguyên liệu và cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế hiệu suất q trình thủy phân. Nếu cellulose khơng được tiền xử lý, hiệu quả thủy phân thấp. Xử lý loại bỏ hemicelluose sẽ làm tăng khả năng thủy phân do tăng cấu trúc xốp bề mặt cellulose, làm cho enzyme dễ tấn công hơn. + Ảnh hưởng của nhiệt độ
Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và đến mức triệt tiêu.
Hình 12: Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ [10]
Nhiệt độ
Tốc độ ph
ản ứ
Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme khơng có khả năng phục hồi hoạt tính. Ngược lại khi ở nhiệt độ 0o
C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.
+ Ảnh hưởng của pH
pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở nhiều môi trường pH khác nhau: trung tính, acid yếu, kiềm yếu. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-5, trong đó tốt nhất là 4.8. Ảnh hưởng đó được trình bày trong hình 13.
Hình 13: Ảnh hưởng của pH [10] + Nồng độ enzyme + Nồng độ enzyme
Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng tăng theo đường thẳng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng. Khi đó, tốc độ phản ứng sẽ khơng tăng nữa mà là một đường nằm ngang như trong hình vẽ 14.
Hình 14: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme [10]
pH Tốc độ ph ản ứ ng Nồng độ Enzyme Tốc độ ph ản ứ ng
+ Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ có nhiều cơ chất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị bão hòa cơ chất, vì vậy, tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể.
Hình 15: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [10] + Ảnh hưởng của các chất kìm hãm + Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme. Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein.
Đối với enzyme cellulase, các nghiên cứu nhận thấy, sản phẩm của phản ứng thủy phân, bao gồm cả cellobiose và glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc biệt là cellobiose.
Bƣớc 3: Lên men
Bản chất của quá trình lên men là q trình oxy hóa khử. Q trình oxy hóa này lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta gọi quá trình lên men là q trình oxy hóa sinh học. Sự tạo thành rượu từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, sơ đồ hình thành rượu từ glucose được diễn ra theo phản ứng từ axit piruvic chuyển hóa thành ethanol dưới các tác nhân xúc tác.
a. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [11]
+ Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu trong khoảng 28-320C. Ở
Nồng độ cơ chất
Tốc độ ph
ản ứ
nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh. Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo sản phẩm phụ như ester, aldehyd và tổn thất ethanol theo CO2 sẽ tăng.
+ pH
Nồng độ ion H+
trong môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5-5,0. Nếu pH thấp khoảng 3,0 – 4,0 nấm men còn hoạt động được nhưng nếu pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp.
+ Nồng độ của dịch lên men.
Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Mặt khác nếu nồng độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển. Thông thường nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22% khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào có thể bị vỡ).
+ Thời gian
Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,… Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng mơi trường và mục đích của q trình lên men cụ thể.
Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy để tích lũy một lượng sinh khối. Tiếp theo, để chuyển hóa đường thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong điều kiện yếm khí hồn tồn để ức chế hô hấp của nấm men và buộc chúng phải lên men để tạo năng lượng. Khi đó, nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2.
+ Nồng độ CO2 trong mơi trường
CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường, sẽ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không làm khả năng lên men yếu đi.
Trong mơi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thốt ra ngồi, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp. CO2 nằm trong khoảng khơng giữa bề mặt mơi trường và khơng khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại.
+ Hàm lượng giống nấm men.
Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đường thành ethanol và khí CO2. Mỗi lồi nấm men có khả năng lên men khác nhau. Cùng loài nấm men, nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì khả năng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau.
+ Thành phần các chất dinh dưỡng của môi trường lên men
Mơi trường ni cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vô cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng.
b. Vi sinh vật lên men glucose thành ethanol [11]
Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có thể thể lên men chuyển hóa đường thành ethanol. Việc lựa chọn một chủng nấm men thích hợp là rất cần thiết.
Nấm mem: Những giống nấm men thường được sử dụng trong công nghiệp
sản xuất cồn như Saccharomyces spp. Một số loài như S. Cerevisiea, S. unvarum là giống có khả năng tạo độ cồn cao (12-13%), đặc biệt S. oviformis có khả năng tạo độ cồn 18% và lồi nấm men này có khả năng lên men được rất nhiều đường khác nhau như glucose, manose, saccharose, maltose và rafinose, ngoại trừ galactose.
Vi khuẩn: Một số vi khuẩn được quan tâm như zomomonas mobilis. Đây là
loại vi khuẩn có khả năng lên men đồng hình sinh ethanol và chịu được nồng độ cồn tới 120g/l. Ngồi ra, vi khuẩn này tạo ra ít sinh khối hơn do vậy mà lượng glucose chuyển trực tiếp thành ethanol cũng cao hơn.
Quá trình thủy phân và lên men đồng thời.
Một trong những cải biến quan trọng trong ứng dụng enzyme là công nghệ kết hợp cả hai quá trình thủy phân và lên men trong cùng một cơng đoạn – quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời SSF (Simultaneous Saccharification and
Fermentation). Phương pháp này đạt được hiệu suất 50 – 72% ethanol cho mỗi gam glucose, giới hạn bởi khả năng chịu ảnh hưởng của nấm men đối với ethanol.
Bảng 6: Các thơng số vận hành và kết quả q trình thủy phân và lên men đồng thời tại một số nước [10]
Biomass Nồng độ Glucose Nồng độ Cellulase Ethanol Thời gian lƣu g/l IFTU/g cellulose Hiệu suất % g/l Ngày Rơm lúa mì 51 28 49 14 1 Bã mía 50 28 53 15 1 Rơm lúa mì 75 7 66 28 4-7 Rơm lúa mì 75 13 73 31 4-7 Rơm lúa mì 75 26 75 32 4-7
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình là 37-38oC, nhiệt độ này là sự kết hợp của quá trình thủy phân (45-50oC) và nhiệt độ tốt nhất cho hoạt động của nấm men (30oC). Trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời, enzyme cellulase và β-glucosidase bị ức chế bởi cellobiose, glucose và ethanol.
Đối với nấm men saccharomyces cerevisiae, glycerol là sản phẩm phụ lớn
nhất. Glycerol tạo thành tăng theo nhiệt độ của quá trình và sẽ có ảnh hưởng đến nồng độ ethanol trong dung dịch. Một số kết quả nghiên cứu cho kết quả như sau:
Bảng 7: Kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời với rơm đã qua tiền xử lý bằng acid lỗng, q trình được tiến hành trong điều kiện kỵ khí [10]
Chủng nấm mem Enzym FPU/g Cơ chất Ethanol (g/l) Hiệu suất (%) Glycerol (mg/g) Axit Succinic (mg/g) Axit Pivuric (mg/l) Axit Acetic (mg/g) S. cerevisiae 15 Avicel 12,64 0,46 44,62 1,62 62,6 0,3 1,1 1,2 S. cerevisiae 30 Avicel 15,20 0,55 53,65 1,94 79,4 0,8 1,5 1,9 S. cerevisiae 15 Rơm 6,83 0,25 40,69 1,49 83,9 0,5 2,0 3,9
Ưu, nhược điểm của quá trình thủy phân và lên men đồng thời