Dòng EOF di chuyển từ cực dƣơng sang cực âm. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, các cation di chuyển cùng chiều với dịng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngƣợc lại các anion di chuyển ngƣợc chiều với dịng EOF do đó di chuyển chậm hơn cịn các phần tử trung hịa khơng chịu tác động của điện trƣờng nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF. Nhƣ vậy, dịng EOF đóng vai trị quan trọng trong việc xác định thời gian tồn tại chất tan ở trong ống mao quản. Vì vậy phải lựa chọn các điều kiện điện di phù hợp nhất để có tốc độ dịng điện di phù hợp cho q trình tách sắc ký hỗn hợp chất.
b) Dung dịch đệm điện di:
Dung dịch đệm điện di đƣợc dùng để tạo mơi trƣờng cho q trình điện di xảy ra khi áp thế cao vào hai đầu mao quản. Các yếu tố nhƣ bản chất, thành phần, độ nhớt và giá trị pH của pha động điện di có ảnh hƣởng trực tiếp lên bề mặt mao quản từ đó ảnh hƣởng đến kết quả của quá trình điện di. Ngồi ra trong q trình điện di, hai đầu mao quản đƣợc đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di.
c) Nguồn điện thế cao:
Thƣờng dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nh m sinh ra điện trƣờng lớn cho q trình điện di xảy ra. Để phân tích các cation thì áp cực dƣơng vào đầu bơm mẫu của mao quản và ngƣợc lại để phân tích các anion thì áp cực âm vào đầu bơm mẫu của mao quản.
d) Detector:
Detector là bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau q trình điện di, do đó thƣờng đƣợc đặt ở phần cuối hoặc gần cuối của mao quản. Các loại cảm biến thông dụng trong phƣơng pháp CE bao gồm: Hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, điện thế (đo dòng, đo thế, độ dẫn), độ dẫn nhiệt, chỉ số chiết suất của chất [5].
Trong luận văn này, detector đƣợc sử dụng là detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D). Đây là một detector đa năng, có độ nhạy khá cao, có thể dùng cho nhiều loại chất phân tích khác nhau, có thể chế tạo thu nhỏ và tối ƣu hóa cho mục tiêu phân tích ngồi hiện trƣờng. Tuy trở ngại khi dùng detector đo độ dẫn để định lƣợng chất phân tích là dịng điện di trong điện trƣờng mạnh ảnh hƣởng tới tín hiệu đo, thơng thƣờng dịng nền rất lớn do dung dịch đệm đƣợc pha chế từ các chất điện ly. Nhƣợc điểm này đƣợc khắc phục qua việc khảo sát chọn dung dịch đệm, nồng độ, pH để hạn chế dòng nền, tăng dịng chất phân tích. Cịn phƣơng pháp CE với detector DAD có độ nhạy kém do bề dày lớp đo quang trong mao quản có kích thƣớc nhỏ, dù đã đƣợc cải tiến nhƣng còn nhiều hạn chế.
e) Bộ phận điều khiển:
Thƣờng là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích. Hiện nay, bộ phận này cịn có thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hố của q trình phân tích từ khâu bơm mẫu đầu vào đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của q trình phân tích điện di.
1.4.2.2.4. Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE
Mẫu phân tích đƣợc nạp vào mao quản b ng các phƣơng pháp: Có 2 phƣơng pháp bơm mẫu vào mao quản là phƣơng pháp thuỷ động lực học (dùng áp suất hoặc theo kiểu xiphông) và điện động học. Các phƣơng pháp bơm mẫu đƣợc mơ tả trong Hình 1.6.
Hình 1.6. Các phương pháp bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản
a) Kỹ thuật bơm mẫu thuỷ động lực học dùng áp suất:
+ Dùng một áp suất thích hợp khoảng 50 đến 300 mBar để nén (đẩy) hoặc hút một lƣợng vào đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định (hình A).
+ Kiểu xiphơng: Dựa trên sự chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản, chiều cao chênh lệch từ 10-30 cm trong khoảng thời gian từ vài giây đến vài phút tuỳ nồng độ chất phân tích (hình B).
b) Kỹ thuật bơm mẫu kiểu điện động học:
Nguyên tắc của kỹ thuật này là dùng lực của dòng điện với một điện thế cao (5-10 kV trong vài giây) để đƣa mẫu phân tích vào mao quản (hình C) trong một thời gian nhất định. Phƣơng pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên phƣơng pháp có nhƣợc điểm rất lớn là diện tích pic có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do đó thƣờng chỉ dùng để định tính [5,14].
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là ứng dụng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4
D) để định lƣợng các kháng sinh nhóm β-lactam trong mẫu dƣợc phẩm, từ kết quả khảo sát thu đƣợc để áp dụng phân tích với một số mẫu chế phẩm đang lƣu hành trên thị trƣờng. Đồng thời cũng hƣớng đến mục tiêu áp dụng một cách hiệu quả, linh hoạt quy trình phân tích này vào các phòng kiểm nghiệm hoặc các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều loại kháng sinh bao gồm các thuốc đơn hoạt chất và các thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau, đƣợc chia theo hai nhóm:
+ Nhóm 1 là nhóm chế phẩm riêng rẽ chỉ chứa đơn hoạt chất nhóm β-lactam: Cephalexin, Cefotaxime Natri, Cefixime và Sulbactam
+ Nhóm 2 là nhóm chế phẩm phối hợp giữa các hoạt chất nhóm β-lactam và Sulbactam: Amoxcillin, Ampicillin, Cefaperazone và Sulbactam
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao gồm: - Tổng quan các tài liệu về kháng sinh nhóm β-lactam trong mẫu dƣợc phẩm. - Khảo sát các điều kiện tối ƣu để xác định đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong mẫu dƣợc phẩm:
+ Khảo sát loại đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm. + Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản.
+ Khảo sát thời gian bơm mẫu. + Khảo sát chiều cao bơm mẫu. - Đánh giá phƣơng pháp phân tích:
+ Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn.
+ Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ). + Đánh giá độ đúng, đánh giá độ chụm của phƣơng pháp phân tích.
- Phân tích một số mẫu dƣợc phẩm đang lƣu hành trên thị trƣờng có chứa các hoạt chất kháng sinh nghiên cứu với các điều kiện tối ƣu đã khảo sát đƣợc.
- Thực hiện phân tích đối chứng kết quả hàm lƣợng hoạt chất kháng sinh trong một số mẫu dƣợc phẩm b ng phƣơng pháp LC-MS/MS.
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 2.2.1. Trang thiết bị, dụng cụ 2.2.1. Trang thiết bị, dụng cụ
2.2.1.1. Thiết bị
+ Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu là hệ CE-C4D bán tự động sử dụng detector độ dẫn khơng tiếp xúc (Hình 2.1) đƣợc thiết kế lắp đặt với sự tài trợ của Công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) phối hợp với Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Basel, Thụy sĩ.
Hình 2.1. Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D
(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén)
Thiết bị đƣợc cung cấp với thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, chi phí thấp, vừa đƣợc sử dụng để phân tích trong phịng thí nghiệm, vừa có thể đƣợc tối ƣu cho mục tiêu phân tích tại hiện trƣờng.
+ Cân phân tích của hãng Scientech độ chính xác 10-2, 10-4 (gam). + Máy lọc nƣớc deion (Mỹ).
+ Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521.
+ Máy đo pH của hãng HANNA, điện cực thủy tinh, các dung dịch pH chuẩn 4,7,10 để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH.
+ Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu.
2.2.1.2. Dụng cụ:
+ Pipet paster các loại: 20, 100, 200, 1000 µL.
+ Các lọ falcon 15; 25 ml để đựng mẫu và dung dịch chuẩn. + Giấy lọc đƣờng kính màng lọc là 0,45 µm.
+ Mao quản sử dụng là mao quản silica, chiều dài 60 cm, đƣờng kính trong (ID) là 50 µm.
+ Một số dụng cụ thủy tinh thơng thƣờng khác trong phịng thí nghiệm nhƣ: Bình định mức 10 ml, 25 ml, 100 ml pipet bầu các loại 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, bình tia, que khuấy.
2.2.2. Hố chất:
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA) và đƣợc pha chế b ng nƣớc deion.
2.2.2.1. Chất chuẩn:
Các chất chuẩn đƣợc dùng trong nghiên cứu đều đƣợc mua ở Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng gồm:
+ Cefalexine + Cefotaxim natri + Cefixime trihydrate + Amoxicillin trihydat + Ampicillin trihydat + Cefoperazon + Sulbactam
2.2.2.2. Hóa chất dung mơi:
+ L-Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, Japan, >99%)
+ Tris (hydroxymethyl) aminomethane, (Fluka, Japan, hàm lƣợng >99%) + Ascobic (>99%, Acros Organic (USA))
+ Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) + Axit clohydric (HCl) (Merck, Đức)
+ Axit axetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)
+ Nƣớc deion: Là nƣớc cất hai lần đƣợc lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết
2.2.2.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất
a) Pha dung dịch chuẩn gốc: Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ 1000 ppm tƣơng ứng với 7 chất phân tích từ chất chuẩn rắn trong nƣớc deion.
Cân chính xác 0,0250 g mỗi loại chất chuẩn, chuyển vào bình định mức 25,0 ml. Thêm khoảng 10 đến 15 ml nƣớc deion và rung siêu âm trong 40 phút, định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C và sử dụng trong 2 tháng. Các dung dịch trƣớc khi sử dụng phải đƣa về nhiệt độ phòng, lắc đều dung dịch trƣớc khi sử dụng.
b) Pha dung dịch đệm điện di:
Hệ đệm dùng trong nghiên cứu là hệ Tris (10mM)/Ace ở khoảng pH 7,5 và 7,8: Cân 0,1211 g Tris trên cân phân tích hịa tan và rung siêu âm đến tan b ng nƣớc deion, chuẩn lại giá trị pH b ng acid acetic trên máy đo pH về pH 7,8 và 7,5 rồi định mức đến vạch b ng nƣớc deion, dung dịch đệm đƣợc pha mới hàng ngày.
2.3. Thông tin mẫu và phƣơng pháp xử lý mẫu thuốc
2.3.1. Thông tin các mẫu thuốc
Thông tin các mẫu thuốc sử dụng để phân tích đƣợc tóm tắt ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2. Thông tin chi tiết các mẫu này đƣợc nêu ở Bảng PL.1 và Bảng PL.2 (phụ lục 1).
Bảng 2.1. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 1
Stt Tên thuốc Mã thuốc thuốc Dạng Hàm lƣợng ghi trên nhãn 1 Fabafixim 200 D CFX1 Viên nén Mỗi viên chứa 200 mg Cefixim 2 Fabafixim 400 CFX2 Viên nang Mỗi viên chứa 400 mg Cefixim 3 Cefimed 200 CFX3 Viên nén Mỗi viên chứa 200 mg Cefixim 4 Cefalexin 500mg CFL4 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 5 Franlex 500 CFL5 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 6 GOLDCEFO 1G CFT2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 g Cefotaxime 7 Cefalexin 500mg CFL-CH1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 8 BICEBID 100 CFX-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 100 mg Cefixime 9 Cefalexin 500mg CFL-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 10 Cefalexin 500mg CFL-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin 11 CEFIXIM 100mg CFX-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 100 mg Cefixime 12 Cefalexin 500mg CFL-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin
Bảng 2.2. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 2
Stt Tên thuốc Mã thuốc Dạng
thuốc Hàm lƣợng ghi trên nhãn 1 Amoxicillin 500 AM1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 2 Amoxicillin 500 AM2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 3 Amoxicillin AM3 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 4 Ospamox 500 AM4 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 5 Ampicillin 500 AP1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 6 Ampicillin 500 AP2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 7 Amoxicillin 500 AM-CH1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxcillin 8 Amoxicillin 500 AM-CH2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 9 Amoxicillin 500 AM-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 10 Ampicillin 500 AP-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin
11 Amoxicillin 500 AM-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 12 Ampicillin 500 AP-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 13 Amoxicillin 500 AM-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 14 Ampicillin 500 AP-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 15 Auropennz 1.5 APvSB1 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Ampicillin, 0.5 gam Sulbactam, 5 ml nƣớc cất tiêm 16 SUKLOCEF CPvSB Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Cefoparazone,
0.5 gam Sulbactam
17 Sumakin 1.5gam AMvSB1 Dạng gói Mỗi gói chứa 250 mg Amoxicillin, 250 mg Sulbactam
18 MOXYBIOTIC-
S 1.5g AMvSB2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Amoxicillin, 0.5 gam Sulbactam
19 BACTAMOX
625 AMvSB3 Dạng gói Mỗi gói chứa 500 mg Amoxicillin, 125 mg Sulbactam
20 UNASYN 1.5g APvSB2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 g Ampicillin, 0,5 g Sulbactam, 5 ml nƣớc cất tiêm
2.3.2. Phương pháp xử lí mẫu
a) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nang
Lấy 10 viên thuốc cân chính xác khối lƣợng (đƣợc khối lƣợng viên thuốc), bỏ phần nang thuốc để lấy phần thuốc bột, trộn đều. Lau sạch phần nang thuốc rồi đem cân khối lƣợng (đƣợc khối lƣợng phần nang thuốc) để tính khối lƣợng trung bình viên. Cân chính xác một lƣợng nhỏ 1/100 khối lƣợng bột đã trộn đều ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nƣớc deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha lỗng trƣớc khi đƣợc bơm mẫu vào thiết bị CE [3].
b) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nén
Lấy 10 viên thuốc dạng nén, cân chính xác khối lƣợng để tính khối lƣợng trung bình viên. Tiến hành nghiền b ng cối mã não đến khi thành dạng bột mịn, trộn đều rồi cân chính xác khoảng 1/100 khối lƣợng bột ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nƣớc deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha lỗng trƣớc khi bơm mẫu vào thiết bị CE.
c) Xử lí mẫu dạng bột tiêm
Cân chính xác khối lƣợng của 1 lọ thuốc, sau đó lấy hết lƣợng thuốc trong lọ ra, trộn đều. Tráng rửa sạch vỏ lọ và sấy tới khối lƣợng không đổi, cân vỏ lọ (đƣợc khối lƣợng vỏ lọ) để tính đƣợc khối lƣợng thuốc trong 1 lọ. Sau khi trộn đều thuốc, cân chính
xác khoảng 1/40 khối lƣợng bột thuốc cho vào bình định mức 25,0 ml rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha loãng trƣớc khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE.
2.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích
+ Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với các quá trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 3.
+ Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Đối với các quá trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 10 [10].
2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp
Độ chụm (độ lặp lại) một cách tƣơng đối là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá trị trung bình trên các mẫu thử giống hệt nhau trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau (cùng ngƣời phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí nghiệm trong các khoảng thời gian ngắn).
Độ chụm (độ lặp lại) có thể xác định qua độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%). Khi độ lệch chuẩn càng lớn thì sai số của phép đo hay của phƣơng pháp càng lớn [10]. Cơng thức tính SD và %RSD là: SD = √∑ %RSD = x100 Trong đó:
+ Si: Diện tích của pic điện di thứ i
+ Stb: Diện tích trung bình của n lần phân tích