Stt Tên thuốc Mã thuốc Dạng
thuốc Hàm lƣợng ghi trên nhãn 1 Amoxicillin 500 AM1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 2 Amoxicillin 500 AM2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 3 Amoxicillin AM3 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 4 Ospamox 500 AM4 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 5 Ampicillin 500 AP1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 6 Ampicillin 500 AP2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 7 Amoxicillin 500 AM-CH1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxcillin 8 Amoxicillin 500 AM-CH2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 9 Amoxicillin 500 AM-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 10 Ampicillin 500 AP-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin
11 Amoxicillin 500 AM-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 12 Ampicillin 500 AP-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 13 Amoxicillin 500 AM-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin 14 Ampicillin 500 AP-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin 15 Auropennz 1.5 APvSB1 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Ampicillin, 0.5 gam Sulbactam, 5 ml nƣớc cất tiêm 16 SUKLOCEF CPvSB Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Cefoparazone,
0.5 gam Sulbactam
17 Sumakin 1.5gam AMvSB1 Dạng gói Mỗi gói chứa 250 mg Amoxicillin, 250 mg Sulbactam
18 MOXYBIOTIC-
S 1.5g AMvSB2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Amoxicillin, 0.5 gam Sulbactam
19 BACTAMOX
625 AMvSB3 Dạng gói Mỗi gói chứa 500 mg Amoxicillin, 125 mg Sulbactam
20 UNASYN 1.5g APvSB2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 g Ampicillin, 0,5 g Sulbactam, 5 ml nƣớc cất tiêm
2.3.2. Phương pháp xử lí mẫu
a) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nang
Lấy 10 viên thuốc cân chính xác khối lƣợng (đƣợc khối lƣợng viên thuốc), bỏ phần nang thuốc để lấy phần thuốc bột, trộn đều. Lau sạch phần nang thuốc rồi đem cân khối lƣợng (đƣợc khối lƣợng phần nang thuốc) để tính khối lƣợng trung bình viên. Cân chính xác một lƣợng nhỏ 1/100 khối lƣợng bột đã trộn đều ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nƣớc deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha loãng trƣớc khi đƣợc bơm mẫu vào thiết bị CE [3].
b) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nén
Lấy 10 viên thuốc dạng nén, cân chính xác khối lƣợng để tính khối lƣợng trung bình viên. Tiến hành nghiền b ng cối mã não đến khi thành dạng bột mịn, trộn đều rồi cân chính xác khoảng 1/100 khối lƣợng bột ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nƣớc deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha loãng trƣớc khi bơm mẫu vào thiết bị CE.
c) Xử lí mẫu dạng bột tiêm
Cân chính xác khối lƣợng của 1 lọ thuốc, sau đó lấy hết lƣợng thuốc trong lọ ra, trộn đều. Tráng rửa sạch vỏ lọ và sấy tới khối lƣợng không đổi, cân vỏ lọ (đƣợc khối lƣợng vỏ lọ) để tính đƣợc khối lƣợng thuốc trong 1 lọ. Sau khi trộn đều thuốc, cân chính
xác khoảng 1/40 khối lƣợng bột thuốc cho vào bình định mức 25,0 ml rồi định mức tới vạch b ng nƣớc deion. Dung dịch thu đƣợc đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và đƣợc pha loãng trƣớc khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE.
2.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích
+ Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với các quá trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 3.
+ Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Đối với các quá trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 10 [10].
2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp
Độ chụm (độ lặp lại) một cách tƣơng đối là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá trị trung bình trên các mẫu thử giống hệt nhau trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau (cùng ngƣời phân tích, cùng trang thiết bị, phịng thí nghiệm trong các khoảng thời gian ngắn).
Độ chụm (độ lặp lại) có thể xác định qua độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%). Khi độ lệch chuẩn càng lớn thì sai số của phép đo hay của phƣơng pháp càng lớn [10]. Cơng thức tính SD và %RSD là: SD = √∑ %RSD = x100 Trong đó:
+ Si: Diện tích của pic điện di thứ i
+ Stb: Diện tích trung bình của n lần phân tích + n: Số lần phân tích lặp lại
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp
Độ đúng của phƣơng pháp chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ
đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hay b ng cách xác định độ thu hồi. Độ thu hồi thƣờng đƣợc xác định b ng phƣơng pháp thêm chuẩn với công thức sau [10]:
Độ thu hồi (H): H = lt tt C C x 100% Trong đó:
+ H: Hiệu suất thu hồi (%)
+ Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu đƣợc (tính theo đƣờng chuẩn) + Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính từ lƣợng chuẩn thêm vào. Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lí mẫu ta có độ đúng của phƣơng pháp, còn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị CE ta có độ đúng của thiết bị. Trong nghiên cứu này, ba mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) đƣợc lựa chọn để đánh giá độ thu hồi tƣơng ứng là: Nhóm 1 ở mức nồng độ (60, 80, 100) ppm, nhóm 2 ở mức nồng độ (50, 60, 70) ppm so với nồng độ làm việc của hoạt chất và có mặt nền mẫu (nếu khơng có mẫu tự tạo). Thực hiện nhƣ sau:
1. Từ bột chế phẩm pha 1 dung dịch (dd) khoảng 200 ppm cho mỗi hoạt chất (làm dd nền gốc A).
2. Chuẩn bị một dung dịch chuẩn có nồng độ mỗi hoạt chất 200 ppm (dd B). 3. Chuẩn bị các dung dịch đánh giá độ đúng.
a) Nhóm 1:
+ Mức 60 ppm: Lấy 100 l dd A + 200 l dd B + 700 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 60 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 40 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 80 ppm: Lấy 100 l dd A + 300 l dd B + 600 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 80 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 60 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 100 ppm: Lấy 100 l dd A + 400 l dd B + 500 l nƣớc, lọc đƣợc dung
dịch có nồng độ khoảng 100 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 80 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
b) Nhóm 2:
+ Mức 50 ppm: Lấy 100 l dd A + 150 l dd B + 750 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 50 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 30 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 60 ppm: Lấy 100 l dd A + 200 l dd B + 700 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 60 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 40 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
+ Mức 70 ppm: Lấy 100 l dd A + 250 l dd B + 650 l nƣớc, lọc đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 70 ppm (trong đó khoảng 20 ppm từ mẫu chế phẩm, 50 ppm chính xác là chuẩn thêm vào).
c) Dung dịch để đánh giá nồng độ A: Lấy 500 l dd A + 500 l nƣớc, lắc đều tiêm điện di (dd C).
Từ kết quả nồng độ dung dịch C và nồng độ các dung dịch thêm chuẩn sẽ tính ra đƣợc độ thu hồi theo hai nhóm ở các nồng độ khác nhau, qua kết quả khảo sát có kết luận về độ đúng (tỷ lệ thu hồi từ 98 – 102%, dao động giữa 3 lần phân tích ở mỗi mức thêm chuẩn RSD không quá 2 %).
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu hảo sát phân tích đồng thời bốn hoạt chất kháng sinh nhóm 1 bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D
3.1.1. Tối ƣu hố các điều kiện phân tích
Khảo sát một số điều kiện phân tích 4 hoạt chất nhóm 1 đƣợc tiến hành trên thiết bị điện di mao quản CE-C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm đƣờng kính trong 50 µm, thế áp vào hai đầu mao quản là +17kV, nồng độ khảo sát của các chất đều là 50 ppm. Các điều kiện khảo sát gồm: Ảnh hƣởng của thành phần và pH của dung dịch đệm điện di, nồng độ đệm, chiều dài hiệu dụng của mao quản, thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu.
3.1.1.1. hảo sát loại đệm và pH của dung dịch đệm điện di
Việc khảo sát đồng thời thành phần và pH của dung dịch đệm điện di với các hoạt chất nghiên cứu ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình di chuyển và phân tách của các chất trong dung dịch.
Trong phƣơng pháp điện di mao quản, khi pH của dung dịch đệm thay đổi sẽ làm thay đổi độ dẫn của dung dịch, từ đó làm thay đổi thời gian di chuyển của các chất phân tích trong mao quản. Do đó, việc chọn các dung dịch đệm điện di cần đảm bảo hai yếu tố là pH phù hợp và detector là detector đo độ dẫn nên dung dịch đệm cần có độ dẫn nhỏ.
Quá trình khảo sát đƣợc tiến hành với ba hệ đệm sau Arg/Ascobic 15 mM; Arg/Ace 15 mM; Tris/Ace 15 mM ở các giá trị pH khác nhau, giá trị pH đƣợc điều chỉnh trên cơ sở thêm dần hợp phần acid (Acetic hoặc Ascobic) vào và giữ nguyên hợp phần bazơ (Tris, Arg) với nồng độ 15 mM cho đến khi đạt giá trị pH muốn khảo sát. Kết quả khảo sát thu đƣợc đƣợc trình bày trong các Hình 3.1; 3.2 và 3.3.
750 700 650 600 550 500 pH=8,0 pH=8,5 pH=9,0 (CFL) (CFT) (SBT) (CFX) 5 mV
Hình 3.1. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ascobic ở các pH khác nhau
Từ kết quả khảo sát thu đƣợc cho thấy đệm Arg/Ascobic không thật sự phù hợp để phân tích vì đƣờng nền nhiễu, pic thu đƣợc nhỏ, chân dỗng và khơng cân đối. Ở pH < 8,5 thời gian di chuyển lớn và khơng thấy xuất hiện pic Cefixime. Do Arg có pKa = 12,488. Vì vậy, để ion hóa các phân tử này cho phân tách b ng CE cần phải sử dụng các dung dịch đệm điện di kiềm mạnh, điều này không khả thi với hệ CE-C4D do yêu cầu độ dẫn điện nền thấp.
Hình 3.2. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ace ở các pH khác nhau
Đệm Arg/Ace cho pic ra ổn định, nhƣng chân rất dỗng, tín hiệu pic khơng lớn, thời gian di chuyển lâu. Vì vậy đệm này khơng thật sự phù hợp để lựa chọn.
Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau
Từ kết quả khảo sát đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau nhận thấy: Ở pH ≤ 7,5 thời gian di chuyển của các pic sẽ lâu hơn, tín hiệu nhiễu và pic thu đƣợc nhỏ, chân pic bị doãng. Ở pH ≥ 8,0 hai pic Cefalexin và Cefotaxime sẽ bị dính và dần bị trùng vào nhau. Do khi pH tăng làm cho dòng EOF tăng, độ linh động điện di của chất phân tích tăng,
550 500 450 400 350 300 250 (CFT) (SBT) (CFX) pH=7,5 pH=8,0 pH=8,5 5mV
Thêi gian di chun (s) (CFL) 350 300 250 200 150 (CFL) (CFT) (SBT) (CFX) pH=7,0 pH=7,5 pH=7,7 pH=7,8 pH=8,0 5mV
chất phân tích ra nhanh hơn (thời gian di chuyển giảm), khả năng tách chất giảm đi -> làm các pic dễ dính hoặc trùng nhau. Ở pH = 7,7 pic chất của Cefalexin gần EOF hơn nên sẽ rất dễ chịu tác động của dịng này trong suốt q trình phân tích. Ở pH = 7,8 các pic chất lên đẹp, độ phân giải phù hợp, đƣờng nền phẳng, tín hiệu ổn định. Vì vậy đệm Tris/ace ở pH = 7,8 là phù hợp nhất để lựa chọn và sẽ đƣợc giữ cố định trong các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ hệ đệm điện di
Trong phƣơng pháp điện di mao quản, nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trƣờng điện ly ổn định cho các ion di chuyển và không tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản làm ảnh hƣởng đến quá trình di chuyển của các ion. Nồng độ của các cấu tử trong dung dịch đệm điện di sử dụng trong phƣơng pháp CE-C4D thƣờng lớn hơn hoặc b ng 8 mM [11]. Việc khảo sát đƣợc tiến hành với hợp phần bazơ Tris (pKa= 8,3), với các nồng độ đƣợc thay đổi lần lƣợt là 8 mM; 10 mM; 15 mM và 20 mM, b ng cách thêm dần hợp phần axit axetic đến pH = 7,8. Các kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.4.
Bảng 3.1. Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của bốn chất vào nồng độ đệm điện di
Chất phân tích Nồng độ (ppm) Tris/Ac 8 mM Tris/Ac 10 mM Tris/Ac 15 mM Tris/Ac 20 mM Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Cefalexin 50 10,9 153 12,8 168 13,8 188 16,4 214 Cefotaxime 7,3 158 8,8 176 9,8 198 10,7 222 Sulbactam 8,9 190 10,4 215 11,1 246 13,9 281 Cefixime 4,9 212 6,6 241 7,7 276 9,4 316
Hình 3.4. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Tris trong hệ đệm điện di
Từ kết quả khảo sát hệ đệm Tris/Ace với các nồng độ khác nhau có thể nhận thấy: Khi tăng nồng độ của dung dịch đệm điện di thì thời gian di chuyển của các chất tăng lên, đồng thời diện tích pic cũng tăng.
Với nồng độ đệm 8 mM, đƣờng nền khá ổn định, diện tích các pic chất khá nhỏ, đồng thời pic của Cefalexin lại khá gần dòng EOF nên rất dễ bị ảnh hƣởng của dịng này nên nồng độ này khơng thật sự phù hợp để lựa chọn.
Với nồng độ đệm 15 mM và 20 mM tuy cho diện tích pic lớn hơn, nhƣng đƣờng nền khơng ổn định và hình dáng các pic khơng đƣợc cân đối, thời gian di chuyển lâu hơn. Do đó các nồng độ này cũng khơng phù hợp để lựa chọn.
Với nồng độ đệm 10 mM cho đƣờng nền ổn định hơn so với đƣờng nền của đệm với các nồng độ còn lại, thời gian phân tích nhanh hơn, chiều cao pic lớn hơn, độ phân giải tốt hơn nhƣng diện tích pic lại nhỏ hơn so với nồng độ 15 mM và 20 mM. Vì vậy nồng độ 10 mM là phù hợp nhất để lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
Đƣợc giải thích là khi nồng độ đệm tăng lên thì độ điện di hiệu dụng của các ion dƣơng và âm tăng, do đó làm tăng thời gian di chuyển của chất. Đồng thời làm tăng độ dẫn của dung dịch điện ly dẫn đến làm giảm tín hiệu của chất phân tích. Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng thì nồng độ các ion tăng, làm thay đổi độ lớn của lớp điện kép, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác tĩnh điện của lớp điện kép với thành mao quản. Vì vậy làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng nên nhiễu đƣờng nền làm pic không cân đối và khả năng tách chất kém. Do đó, nồng độ Tris 10 mM đƣợc lựa chọn là nồng độ tối ƣu của hệ đệm và đƣợc cố định cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.3. Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản
Chiều dài hiệu dụng của mao quản ảnh hƣởng không nhỏ đến thời gian di chuyển của các chất. Nếu chiều dài hiệu dụng của mao quản ngắn thì thời gian di chuyển của
350 300 250 200 150 100 20mM 15mM 10mM 8mM (CFL) (CFT) (SBT) (CFX) 5mV