CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Thiết bị và hóa chất
2.3.1. Thiết bị
Máy PCR PTC-100 (MJ. Research Inc., Mỹ). Máy ly tâm eppendorf (Centrifuge 5415D). Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin- Wealtec (Mỹ). Bộ điện di ngang và nguồn điện di (Bio-Rad). Box cấy vơ trùng (Laminair class II). Máy lắc có điều nhiệt để ni cấy tế bào. Máy hút chân khơng Speed-Vac. Máy vortex, lị vi sóng, tủ lạnh -20oC, tủ lạnh -80oC (SANYO)…
2.3.2. Hóa chất
Các loại hóa chất cần thiết trong sinh học phân tử: Yeast extract (DIFCO-Mỹ); trypton (DIFCO-Mỹ); EDTA, SDS, tris (Sigma-Mỹ), acid acetic (Merk-Đức); kanamycin, ampicilin (Merk-Đức); x-gal (Sigma-Mỹ), agarose (Sigma-Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo-Pháp). Các bộ kit sử dụng: Kit tách DNA tổng số của hãng Qiagen (Mỹ); Kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Qiagen (Mỹ); Kit tinh sạch elution “thôi gel” của Qiagen (Mỹ). Các loại enzym giới hạn EcoRI, BamHI, NotI, SmaI, DraI… của các hãng New England - BioLabs (Mỹ), Fermentas (Lithuania).
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu được trình bày ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 2.4.1. Phƣơng pháp thu thập và bảo quản mẫu Fasciola spp.
Mẫu được thu trực tiếp tại các lò mổ gia súc hoặc mẫu trên người do các cơ quan (Viện sốt rét Ký sinh trùng- côn trùng Trung ương và Trường Đại học Y Hà nội) cung cấp.
Mẫu bệnh phẩm là các con sán được rạch/cắt từ các đường ống dẫn trong buồng gan của trâu/bò, rửa sạch mẫu bằng nước muối sinh lý, cố định trong cồn 70% và bảo quản lạnh ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Mẫu SLGL Tách DNA tổng số
Thực hiện PCR
Giải trình tự (Sequencing)
Truy cập ngân hàng gen Xử lý chuỗi nucleotide
c
Phân tích đặc tính SHPT Xây dựng cây phả hệ
2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của từng mẫu riêng biệt được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini kit (hãng QIAGEN Inc, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các mẫu DNA tổng số được kiểm tra nồng độ bằng cách đo OD (Optical Density) trên máy đo quang phổ kế Nanodrop 1000 spectrophotometer.
Mẫu sán lá gan lớn được xử lý bằng cách rửa nước nhiều lần để loại bỏ hết cồn trong quá trình bảo quản mẫu, 2 bên rìa của con sán được cắt ra ~25 mg; mẫu được nghiền trong bộ cối chày nhựa thành dạng huyễn dịch đồng nhất. Sau đó, 200 µl dung dịch tissue lysis buffer (ATL) và 20 µl proteinase K (50 mg/ml) + 4 µl Rnase – A (100 mg/ml) được bổ sung vào, ủ trong bể điều nhiệt ở 55oC trong 2 - 3 giờ, thỉnh thoảng mẫu được vortex cho đến khi mô được phân hủy hồn tồn. 200 µl dung dịch binding buffer (AL) tiếp tục được bổ sung và lắc mạnh rồi ủ ở 70oC trong 30 phút. Tiếp theo, 200 µl dung dịch izopropanol – 2 được thêm vào, vortex khoảng 15 giây. Toàn bộ hỗn dịch được chuyển sang cột có màng lọc, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, phần dung dịch phía dưới cột lọc được loại bỏ. Sau đó, 500 µl dung dịch washing buffer 1 (AW1) được bổ sung vào cột lọc để rửa DNA đã bám vào màng của cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, dịch ly tâm bên dưới cột được loại bỏ. Bước rửa này tiếp tục được thực hiện tương tự như lần 1 với 500 µl dung dịch Washing buffer 2 (AW2). Cột lọc được ly tâm lại 13.000 vòng/ phút trong 1 phút (để làm khô màng) và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới, 60 µl dung dịch elution buffer (EL) được bổ sung, để ở nhiệt độ phịng trong 2 – 3 phút. Sau đó, cột lọc được ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Cuối cùng, phần dung dịch chứa DNA ở bên dưới cột lọc được thu nhận và được ký hiệu mẫu DNA tổng số, bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng.
2.4.3. Thiết kế mồi, thực hiện PCR gen ITS-2 và gen Nad1
2.4.3.1. Thiết kế mồi
Gen Nad1 của hệ gen ty thể sán lá gan Fasciola chứa gen mã hóa protein
Nad1, gen ITS-2 là gen khơng mã hóa protein trong hệ gen nhân được lựa chọn để
tiến hành PCR, giải trình tự, phân tích và so sánh với các lồi sán lá gan khác. Các mồi được thiết kế dựa trên trình tự các gen đã công bố trong ngân hàng gen.
Trình tự mồi được thể hiện trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Các mồi dùng trong phản ứng PCR gen ITS-2 [47], và gen ty thể Nad1. Chuỗi
gen
Tên
primer Trình tự chuỗi primer (5‟→ 3‟)
Kích thƣớc chuỗi gen
ITS-2 3SF GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG ~ 556 bp
BD2R TATGCTTAAATTCAGCGGGT
Nad1 FAND1F ATACTGTGAGCGTATGTGTAG ~ 1 kb
FAND1R GTACTATGTGCGTTATGCTCG
2.4.3.2. Phương pháp thực hiện PCR và điện di kiểm tra sản phẩm
Bộ kit PCR Master mix (Fermentas) được sử dụng để thực hiện PCR. Hỗn hợp phản ứng PCR có tổng thể tích 50 µl, gồm: 25 µl PCR mastermix (Fermentas), 2 µl mỗi loại mồi (10 pmol/µl), 3 µl khn DNA, 2 µl DMSO (dimethyl sulfoxide) và 16 µl nước khử ion DEPC. Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trên máy MJ PTC-100 (USA), chu trình nhiệt gồm: 1 chu kỳ ở 95oC/5 phút, 35 chu kỳ ở [94oC/1 phút, 52oC/3 phút; 72oC/2 phút], chu kỳ cuối ở 72oC/10 phút.
Nguyên lý của điện di:
Dựa trên tính chất hóa học của acid nucleic là: các acid nucleic DNA mang điện tích âm trong mơi trường pH trung tính do đó các gốc phosphat ở khung phosphatdieste trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi chúng di chuyển về cực dương và dừng lại ở điểm có pH đẳng điện (pHi) đặc trưng của mỗi phân tử acid nucleic, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử acid nucleic (loại có trọng lượng phân tử lớn di chuyển chậm hơn loại có trọng lượng phân tử nhỏ) và môi trường đệm điện di. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% sử dụng bộ điện di DNA (Bio-Rad) và chụp hình sản phẩm điện di trên máy soi gel.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị gel agarose 1%: 0,4 g agarose nguyên chất (dạng bột) được cho vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt. Sau đó, 40 ml dung dịch TAE 1X (TAE có thành phần gồm: Tris, acid acetic glacial, EDTA) được thêm vào và cho vào lị vi sóng đặt
nóng chảy trong 2 phút sao cho agarose 1% tan chảy hết. Thạch đã tan chảy được đổ vào hệ thống điện di đã gài sẵn lược, có độ dày khoảng 0,5 mm và để nguội ở nhiệt độ phòng (khoảng 20-30 phút). Tiếp theo, khay thạch được để ngập trong bể điện di chứa đệm TAE 1X. Bước tra mẫu như sau: 10 µl sản phẩm PCR được trộn với 2 µl chỉ thị màu xanh (xanh Bromophenol) và tra riêng biệt vào từng giếng. 6 µl chỉ thị phân tử DNA marker được tra vào giếng đầu tiên của bản gel. Nhờ chỉ thị phân tử DNA mà có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu. Quá trình điện di được chạy ở 100V trong thời gian khoảng 30 - 35 phút. Sau khi chạy điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch Ethidium Bromide (2 µg/µl) trong 10 phút và rửa bằng nước cất. Cuối cùng, bản gel được soi qua tia cực tím (UV) và chụp ảnh trên máy Dolphin-DOC (Wealtech-Mỹ).
2.4.4. Phƣơng pháp giải trình tự
Nguyên lý:
Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa và hoạt động của enzyme DNA – polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, enzyme DNA – polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3„ có chứa nhóm (OH)- tự do, khi gặp nucleotide khơng chứa nhóm 3„-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide.
Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao gồm: vùng liên kết, mồi bám và enzym Taq-polymerase cùng các điều kiện thích hợp.
Thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm dNTP và 1 % ddNTP tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng cho phản ứng nối dài chuỗi đơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiên).
Quá trình đọc trình tự chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5„→3„ dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình tự. Phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềm tin–sinh học.
lý) có độ dài khoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide, thơng thường là từ 500 - 1000 nucleotide.
Các bước tiến hành:
Sản phẩm PCR được tiến hành tinh sạch bằng kit QiAgen Gel Purification Kit (Mỹ), gửi đi đọc trình tự tại Cơng ty Macrogen (Hàn Quốc).
2.4.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu
Trình tự DNA thu nhận được từ máy giải trình tự, được cung cấp ở hai dạng: chuỗi nucleotide thô ở dạng chữ (.txt) và chuỗi nucleoide ở dạng giản đồ chromatogram (.ab1). Chuỗi ở dạng (.txt) cho phép nhận biết chuỗi giải trình tự có đạt yêu cầu hay khơng, cịn chuỗi nucleotide ở dạng (.ab1) cho phép đưa các chương trình chun biệt (ví dụ: Chromas, BioEdit, SeqEd) để phân tích, biên tập chuỗi thơ với mục đích xác định chính xác từng nucetide để có chuỗi cuối cùng (chuỗi tinh hay chuỗi đã biên tập). Chuỗi đã được biên tập (edited) được sử dụng ở dạng .txt, vì ở dạng này, tất cả các chương trình tin-sinh học phân tích gen (ví dụ: MEGA, GeneDoc, Mac Vector) đều có thể nhận biết.
Các chuỗi nucleotide hay amino acid được so sánh, sắp xếp và tính tốn mức độ đồng nhất (identity) và tương đồng (homology) bằng chương trình GeneDoc2.7 làm dữ liệu chuyển nạp vào MEGA6.06 cho phân tích phả hệ.
* Chương trình so sánh và phân tích GeneDoc:
GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình cho máy tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở dạng .msf (multiple sequence file).
Sử dụng chương trình GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid suy diễn, đưa ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp và MEGA cho phân tích phả hệ.
* Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA):
MEGA (Molecular Eolutionary Genetics Analysis) làm một chương trình nối giao diện (interface application) được lập trình dễ sử dụng cho các nhà nghiên cứu di truyền học phân tử với mục đích so sánh đối chiếu các chuỗi gen đồng chức năng từ các chủng loài trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ từ đó suy ra mối quan hệ
nguồn gốc và phả hệ ở góc độ tiến hóa phân tử [58]. * Xử lý số liệu trong nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản đồ chromatogram của chuỗi nucleotide thô bằng chương trình SeqEdv1.03, sau đó so sánh các chuỗi sử dụng chương trình AsemblyLIGN v1.9 và phân tích thành phần nucleotide và amino acid hoặc các đặc tính gen và chuỗi polypeptide bằng hệ chương trình MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. Các trình tự nucleotide hay amino acid được sắp xếp và tính tốn mức độ tương đồng bằng chương trình GeneDoc 2.7, phân tích và xây dựng phả hệ bằng chương trình MEGA6.06 [58], trên máy tính PC.
Các chuỗi gen ITS-2 và Nad1 được sử dụng để phân tích, so sánh về thành
phần nucleotide và amino acid, cũng như phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chủng Fasciola spp của Việt Nam và thế giới. So sánh đối chiếu, phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chuỗi thu nhận trong nghiên cứu với các chuỗi đã công bố của Việt Nam và thế giới đă đăng ký trong Ngân hàng gen.
Mối quan hệ phả hệ nguồn gốc dựa trên trình tự nucleotide hoặc amino acid của một phân đoạn gen giữa các chủng Fasciola spp. sử dụng bằng phương pháp “kết nối liền kề“ (NJ, Neighbour-Joining), với hệ số kiểm định tin tưởng (bootstrap) là 1000 lần [58].
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu nhận gen ITS-2 trong chuẩn đoán phân biệt
3.1.1. Thu thập mẫu sán lá gan lớn và phân loại hình thái
Tiến hành thu nhận các mẫu SLGL gây bệnh trên bò tại tỉnh Cao Bằng (ký hiệu FspCB-VN); mẫu sán lá gan lớn trên bị tại tỉnh Ninh Bình (ký hiệu FspNB- VN) và mẫu sán lá gan lớn trên trâu tại tỉnh Thừa Thiên Huế (ký hiệu FspHU-VN) và bảo quản trong cồn 70%. Tổng số mẫu của tỉnh Cao Bằng là 06 mẫu; số mẫu của tỉnh Ninh Bình là 13 mẫu và số mẫu của tỉnh Thừa Thiên Huế là 10 mẫu (Hình 3.1).
FspCB-VN
FspNB-VN
FspCB-VN FspNB-VN
A B C
Hình 3.1. Hình ảnh sán lá gan lớn: (A) FspCB-VN; (B) FspNB-VN; (C) FspHU-VN
Phân loại sơ bộ về đặc điểm hình thái của các mẫu SLGL thu thập tại 3 tỉnh chúng tôi lựa chọn 3 mẫu đại diện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Trên các mẫu SLGL thu thập tại tỉnh Cao Bằng, chúng tôi lựa chọn mẫu số 1 với các đặc điểm hình thái giống F. hepatica, ký hiệu là FspCB-VN (Hình 3.1A). Tương tự, trên các mẫu SLGL thu thập tại tỉnh Ninh Bình, chúng tơi lựa chọn 1 mẫu với các đặc điểm hình thái giống F. gigantica, ký hiệu là FspNB-VN (Hình 3.1B). Và trên các
mẫu SLGL thu thập tại tỉnh Thừa Thiên Huế, chúng tôi lựa chọn con số 3 ký hiệu FspHU-VN (Hình 3.1C) để tách DNA tổng số bằng bộ kit QIAamp DNA Mini kit (Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3.1.2. Sử dụng gen ITS-2 trong phân loại các loài SLGL
Mẫu sán lá gan lớn FspCB-VN (Cao Bằng); FspNB-VN (Ninh Bình) và mẫu của địa danh Thừa Thiên Huế là FspHU-VN được tách DNA tổng số làm nguồn khuôn cho phản ứng PCR. Các chuỗi gen ITS-2 được nhân lên bằng phản ứng PCR
0,5 kb
với các cặp mồi 3SF – BD2R. Vùng giao gen ITS-2 có độ dài khoảng 550 bp (gồm cả phần 5,8S và 28S của mồi bám vào). Kết quả PCR được trình bày ở Hình 3.2.
M 1 2 0,5 kb 564 bp 2 kb 23,1 kb A 1000 bp M 3 ~ 0,5bp 250 bp 500 bp
Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR của vùng gen ITS-2.
1. Sản phẩm PCR của mẫu FspCB-VN có kích thước ~ 0,5 kb; 2. Sản phẩm PCR của mẫu FspNB-VN có kích thước ~ 0,5 kb; 3. Sản phẩm PCR của mẫu FspHU-VN có kích thước ~ 0,5 kb
M: Chỉ thị phân tử Lamda cắt bằng enzyme HindIII và chỉ thị phân tử 1 kb Hình ảnh điện di ở Hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR có kích thước đúng với dự kiến (~ 0,5 kb) là một băng DNA sáng rõ, đơn băng chứng tỏ cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt phù hợp. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit QiAgen Gel Purification Kit (Mỹ), gửi đi đọc trình tự tại Cơng ty Macrogen (Hàn Quốc).
Sau khi giải trình tự, sử dụng chuỗi nucleotide gen ITS-2 của FspCB-VN; FspNB-VN và FspHU-VN để so sánh trong Ngân hàng gen. Chúng tôi tiến hành so sánh 3 chuỗi gen ITS-2 trong nghiên cứu với trình tự của 16 chuỗi gen ITS-2 của các lồi SLGL khác đã được cơng bố. Kết quả so sánh được thể hiện trong hình 3.3.
Trình tự nucleotide gen ITS2 * 20 * 40 * 60 * 80 FspNB-VN : ATAAACTATCACGACGCCCAAAAAGTCGTGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATCTCCTCTATGAGTAATCATGTGAGG : 81 FspCB-VN : ................................................................................. : 81 FspHU-VN : ....................................A............................................ : 81 FgBDB-VN-E : ................................................................................. : 81 Fsp-GHL-CN : ................................................................................. : 81 Fg(IndoT)- : ................................................................................. : 81 Fsp-Khanhc : ................................................................................. : 81 Fsp(Hel)-C : ................................................................................. : 81 Fsp(hu)-TL : ................................................................................. : 81 Fg-TL-AB20 : ................................................................................. : 81 Fgig-GX-CN : ................................................................................. : 81 Fh(Ca)Spai : ................................................................................. : 81 Fh-AUS-MF6 : ................................................................................. : 81 Fh-ECU-LC0 : ................................................................................. : 81 Fh-C-Bf101 : ................................................................................. : 81 Fh-IR-AB20 : ................................................................................. : 81 Fh-UR-AB01 : ................................................................................. : 81 Fsp-Hokai- : ................................................................................. : 81 Fsp-Saita- : ................................................................................. : 81 * 100 * 120 * 140 * 160 FspNB-VN : TGCCAGATCTATGGCGTTTCCCTAATGTATCCGGATGCACCCTTGTCTTGGCAGAAAGCCGTGGTGAGGTGCAGTGGCGGA : 162 FspCB-VN : ...A............................................................................. : 162 FspHU-VN : ................................................................................. : 162 FgBDB-VN-E : ................................................................................. : 162 Fsp-GHL-CN : ................................................................................. : 162 Fg(IndoT)- : ................................................................................. : 162 Fsp-Khanhc : ................................................................................. : 162 Fsp(Hel)-C : ................................................................................. : 162 Fsp(hu)-TL : ................................................................................. : 162 Fg-TL-AB20 : ................................................................................. : 162 Fgig-GX-CN : ................................................................................. : 162 Fh(Ca)Spai : ................................................................................. : 162 Fh-AUS-MF6 : ................................................................................. : 162 Fh-ECU-LC0 : ................................................................................. : 162 Fh-C-Bf101 : ................................................................................. : 162 Fh-IR-AB20 : ................................................................................. : 162 Fh-UR-AB01 : ................................................................................. : 162 Fsp-Hokai- : ................................................................................. : 162 Fsp-Saita- : ................................................................................. : 162 * 180 * 200 * 220 * 240 FspNB-VN : ATCGTGGTTTAATAATCGGGTTGGTACTCAGTTGTCAGTGTGTTCGGCGATCCCCTAGTCGGCACACTCATGATTTCTGGG : 243 FspCB-VN : ............................................T.......................T............ : 243 FspHU-VN : ..................................................................A.............. : 243 FgBDB-VN-E : ................................................................................. : 243 Fsp-GHL-CN : ............................................T.......................T............ : 243 Fg(IndoT)- : ................................................................................. : 243 Fsp-Khanhc : ............................................T.......................T............ : 243 Fsp(Hel)-C : ............................................T.......................T............ : 243