CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Thu nhận gen Nad1, giải trình tự và phân thích mối quan hệ phả hệ
3.2.4. Xây dựng mối quan hệ phả hệ giữa các loài thuộc lớp sán lá gan
Cây phả hệ xây dựng dựa trên trình tự nucleotide của 19 chuỗi gen Nad1 ở các loài thuộc lớp sán lá Trematoda có xuất xứ từ nhiều quốc gia (Việt Nam, Trung Quốc, Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản, Lào, và Australia) được trình bày ở Hình 3.7.
Kết quả cho thấy, nhóm các mẫu sán lá gan lớn Fasciola spp. được phân định vào các họ Fasciolidae; trong nghiên cứu thì nhóm sán lá gan nhỏ cùng trong lớp Trematoda (lớp sán dẹt) thuộc họ Opisthorchiidae được sử dụng làm nhóm ngoại hợp (Hình 3.7):
Fgig-GX-CN-KF543342 Fgig-CN-NC 024025 Fgig-HU-VN FspNB-VN FspCB-VN Fsp-GHL-CN-KF543343 Fhep-GL-AU-AF216697 Fhep-Spain-KF111633 Fhep-Spain-KF111659 Fhep-M93388 Fhep-JP-AP017707 Fhep-byJP-AP017707 Fjac-Madu-LK-KX787886 Fmag-Koko-CZ-KU060148 Ofel-Tula-RU-EU921260 Oviv-LA-JF739555 Csin-GD-CN-JF729303 Csin-Amur-RU-)FJ381664 Csin-KR-JF729304 61 99 40 98 100 91 92 50 64 96 86 94 60 65 42 98 0.1 Fasciolidae Opisthorchiidae
Hình 3.8. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ về loài giữa các mẫu sán lá dựa trên
thành phần nucleotide của gen Nad1 bằng chương trình MEGA6.06
Ký hiệu (♦) là mẫu Fasciola được sử dụng trong nghiên cứu này
Nhóm thuộc họ Fasciolidae gồm các mẫu sán lá gan lớn Fasciola spp. của Việt Nam trong nghiên cứu là FspCB-VN; FspNB-VN và FspHU-VN được phân thành hai phân nhóm gồm:
i) Mẫu FspCB-VN trong mối quan hệ phả hệ nằm cùng nhóm với FspGHL-CN (dạng lai) của Trung Quốc;
ii) Mẫu FspNB-VN và FspHU-VN nằm trong cùng nhóm với các mẫu
Fasciola spp. của Trung Quốc (mẫu Fgig-CN);
Nhóm ngoại hợp thuộc họ Opisthorchiidae, gồm phân nhóm sán lá gan nhỏ
Clonorchissinensis (Csin-VN) cùng nhóm với các mẫu của Trung Quốc (Csin-CN);
Hàn Quốc (Csin-KR); Nga (Csin-RU) và phân nhóm Opisthorchis viveriini (mẫu
Oviv-VN, Việt Nam; Oviv-LA, Lào). Mẫu Ofel-RU thuộc loài Opisthorchis felineus tạo thành nhánh riêng với các phân nhóm trên.
Sán lá gan lớn thuộc giống Fasciola ở Việt Nam từ trước đến nay đã được xác định là Fasciola gigantica, tuy nhiên, một số cá thể có hình thái giống F. hepatica (F. hepatica – like) trong đó gen ITS-2 của hệ gen nhân giống với F. hepatica còn hệ gen ty thể lại giống với F. gigantica, dẫn đến phát hiện đã có sự lai
chéo loài trong tự nhiên giữa F. hepatica và F. gigantica [21, 24].
Như vậy, sử dụng đơn thuần một phần của gen ty thể là chuỗi gen Nad1 (~ 1 kb) dựa trên trình tự nucleotide xây dựng cây phả hệ cũng được chia làm hai nhóm: một nhóm thuần nhất của F. hepatica và một nhóm bao gồm tất cả các chủng F. gigantica và F. gigantica-like, trong đó có mẫu thuộc kết quả nghiên cứu là FspCB-
VN. Điều này chứng tỏ, tất cả các chủng/mẫu sán lá gan lớn bất luận thuộc dạng thuần hay dạng lai đều có hệ gen ty thể thuộc về lồi F. gigantica được di truyền theo dòng mẹ. Dạng trung gian (dạng lai) này xuất hiện ở cả mẫu sán thu được ở vật chủ trâu, bò và trên người. Đây là một bằng chứng cho dạng gen lai giữa 2 loại sán lá gan lớn tại Việt Nam cũng như Đơng Nam Á. Điều này, góp phần giải thích cơ chế gây bệnh sán lá gan lớn trên người của Việt Nam và Đơng Nam Á có những nét đặc trưng không giống như các vùng khác trên thế giới. Đây chính là một sự đa dạng sinh học và phức tạp của các loài ký sinh trùng truyền lây từ động vật sang người [3].
Như vậy chứng tỏ đã có sự tạo dòng lai ngoại loài (introgressive hybridization) hay lai chéo ngược, trong dân gian còn gọi là hiện tượng "lại giống" ở động vật mà một số dòng lai và dòng thuần F. gigantica đều có khả năng tìm kiếm thích ứng và gây bệnh trên người.
Lai chéo loài ở Fasciola sp. đã được phát hiện nhiều nơi trên thế giới và ghi nhận như một hiện tượng tự nhiên giữa hai loài F. hepatica và F. gigantica tạo ra dạng trung gian (hybrid form/intermediate forms) [25, 27, 54, 66] và đây cũng là hiện tượng tiến hóa rất phổ biến trong lớp Trematoda với những dẫn chứng cụ thể ở loài sán máng Schistosoma [39, 68], sán lá phổi Paragonimus [31]; hoặc ở các loài sán dây Taenia thuộc lớp Cestoda [61]. Vấn đề là ở chỗ, trong dạng lai giữa hai
loài, loài nào cho hệ gen nhân và loài nào cho hệ gen ty thể cần phải được nghiên cứu và khẳng định.
Đối với Fasciola sp. dạng lai, cho đến nay, hệ gen ty thể của chúng có thành phần giống với F. gigantica [21, 24] cũng như khẳng định của kết quả nghiên cứu sử dụng gen Nad1 được trình bày trong nghiên cứu này.
Lai ngoại loài là hiện tượng tiến hóa bất thường chỉ gặp ở lớp sán lá (Trematoda) nói chung và như vậy kết quả của chúng tơi cũng đã minh có dịng lai giữa {F. hepatica (bố)- F. gigantica (mẹ)} trong loài sán lá gan lớn gây bệnh trên gia súc (trâu, bò) ở Việt Nam. Về vấn đề này cần được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm và có những nghiên cứu tiếp theo một cách sâu sắc có hệ thống hơn.
Trong nghiên cứu chúng tơi cũng đã phát hiện mẫu FspCB-VN thu nhận tại tỉnh Cao Bằng là mẫu sán lá gan thuộc dạng lai (hybrid form). Điều này cũng là minh chứng thêm một lần nữa khẳng định trong quần thể sán lá gan lớn tại Việt Nam chắc chắn đã có sự hiện diện và tồn tại “nguồn gốc thủy tổ” của F. hepatica từ trước đây. Cần có thêm các nghiên cứu giải trình tự về các gen/tồn bộ hệ gen ty thể của con lai để xem xét, phân tích về khoảng cách di truyền và mức độ tiến hóa lồi của lồi này.
KẾT LUẬN
1. Nhân bản và giải trình tự nucleotide của ITS-2 và Nad1 ở 03 mẫu Fasciola
spp. Thu nhận từ ba tỉnh ở Việt Nam.
2. Xây dựng 02 cây phát sinh chủng loại của sán lá gan lớn Fasciola spp. Dựa trên trình tự ITS-2 và Nad1.
3. So sánh một số vị trí nucleotide của các mẫu sán lá gan lớn Fasciola spp.
và dựa trên nucleotide tại vị trí 327 để xác định lồi Fasciola spp. Nếu bị khuyết nucleotide tại vị trí này thì thuộc lồi F. gigantica và nếu là Thymine thì thuộc F. hepatica.
4. Định danh được mẫu sán lá gan lớn thu được ở Ninh Bình và Thừa Thiên
Huế là Fasciola gigantica, còn mẫu thu được ở Cao Bằng là dạng lai của bố là
KIẾN NGHỊ
Cần tiếp tục giải trình tự tồn bộ hệ gen ty thể của FspCB-VN dạng lai, thu thập thêm các mẫu sán lá gan lớn tại Việt Nam trên các đối tượng vật chủ khác nhau để có thể xác định tính lai chéo tự nhiên trong quần thể sán lá gan lớn và xây dựng mơ hình tiến hóa theo vùng địa lý hoặc theo địa danh phân bố ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Học viện Quân Y (2008), Ký sinh trùng và côn trùng Y học, Nhà xuất bản Y
học Hà Nội.
2. Nguyễn Quốc Doanh, Lê Thanh Hoà (2006), “Một số đặc điểm hình thái và phân tử của sán lá gan (Fasciola spp.) ở bò của tỉnh Nghệ An và Cao Bằng”,
Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 13(5), tr. 59-67.
3. Trần Thanh Dương, Nguyễn Thu Hương, Nguyễn Thị Hương Bình (2013), “Dạng lai trong mẫu sán lá gan lớn trên trâu bò và người tại Quảng Ngãi”, Tạp
chí Y học thực hành,(1), tr. 48-52.
4. Nguyễn Văn Đề (2003), “Kết quả bước đầu điều tra bệnh sán lá gan lớn ở Khánh Hịa”, Tạp chí y học thực hành, 447, tr. 77-79.
5. Nguyễn Văn Đề (2012), “Cập nhật bệnh ký sinh trùng ở Việt Nam”, Hội nghị
khoa học quốc tế Mekong Health III, tr. 9-12.
6. Nguyễn Văn Đề, Đỗ Tuấn Anh (2011), “Nhiễm sán lá gan lớn trên nhóm bệnh nhân được chẩn đốn là “u gan” tại các bệnh viện Hà Nội 2006-2010”, Tạp chí
Y học Thực hành, (8), tr. 169-171.
7. Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà (2004), “Xác định thành phần loài SLGL trên người Việt Nam từ trứng phân lập trong phân người bằng phương pháp phân tử hệ gen ty thể”, Tạp chí Y học thực hành, 463(7), tr. 42-46.
8. Nguyễn Văn Đề, Lê Khánh Thuận (2004), Sán lá gan (liver flukes), NXB Y
học, Hà Nội.
9. Lê Thanh Hòa (2007), “Chỉ thị di truyền phân tử sử dụng trong giám định, chẩn đoán, phân loại, phả hệ, dịch tễ học và di truyền quần thể ký sinh trùng”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, (11), tr. 9-14.
10. Lê Thanh Hoà, Nguyễn Văn Đề (2002), “Xác định Fasciola gigantica ở Việt
Nam bằng phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể sử dụng gen Nad1
(nicotinamide dehydrogenase subunit 1)”, Tạp chí phịng chống sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, (3), tr. 41-48.
11. Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996), Ký sinh trùng thú y, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 53-62.
12. Nguyễn Trọng Kim (1997), Nghiên cứu sự liên quan đến tỷ lệ nhiễm ấu trùng
sán lá gan ở ốc (KCTG) với tỷ lệ nhiễm sán lá ở trâu bò (KCTC) để đánh giá tình hình dịch tế của bệnh ở một số vùng miền Bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ
Nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Việt Nam, Hà Nội.
13. Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Quang Tuyên (1999), Giáo trình ký sinh trùng thú y, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 37-46.
14. Phan Địch Lân (2004), Bệnh ngã nước trâu bị, NXB Nơng nghiệp Hà Nội, tr. 5 - 55.
15. Nguyễn Thị Lê (1977), Bệnh giun sán từ động vật lây sang người, NXB Khoa
học và Kỹ thuật, Hà Nội.
16. Nguyễn Thị Lê (1995), Danh mục các loài sán lá (trematoda) ký sinh ở chim và
thú Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr. 33-129.
17. Nguyễn Thị Bích Liên, Trần Thị Hồng (2007), “Đánh giá mối liên quan giữa mề đay mạn tính và nhiễm kí sinh trùng”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 2, tr. 48-53.
18. Phạm Văn Lực, Phạm Ngọc Doanh (2006), “Bệnh sán lá gan trâu, bò và các yếu tố nguy cơ lây nhiễm sang người ở tỉnh Đắk Lắk”, Tạp chí Y học Thực hành, (9), tr. 41-43.
19. Đoàn Văn Phúc, Nguyễn Thị Hiền Thảo, Vũ Thị Thận (1980), “Dùng Dertil cho uống tẩy sán lá gan trâu Việt Nam”, Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y (1968 – 1978), NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
20. Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Văn (2011), “SLGL lạc chỗ ở người: Báo cáo loạt ca bệnh và tổng hợp y văn thế giới và Việt Nam 2000-2011, Cơng trình NCKH về bệnh truyền nhiễm và HIV/AIDS giai đoạn 2009 – 2011”, Tạp chí Y
học Thực hành, 781, tr. 118-123.
21. Đỗ Dương Thái, Trịnh Văn Thịnh (1976), Cơng trình nghiên cứu ký sinh trùng
22. Phạm Văn Thân, Huỳnh Hồng Quang (2007), “Đặc điểm sinh học và vài nét về dịch tễ học bệnh SLGL (Fasciola hepatica và Fasciola gigantica)”, Tạp chí Y
học TP Hồ Chí Minh, (11), tr. 2-6.
23. Đặng Tất Thế, Lê Quang Hùng, Cao Văn Viên (2003), “Định loại sán lá gan lớn (giống Fasciola) ở người và gia súc bằng chỉ thị DNA”, Tạp chí Sinh học,
25(4), tr. 47-52.
24. Lương Tố Thu, Norman Aderson, Đoàn Văn Phúc (1997), “Nhận định về các loại thuốc trị sán lá gan lớn và kết quả thử nghiệm trên trâu bò ở Việt Nam”,
Tạp chí Hội thú y Việt Nam, 3, tr. 6-12.
25. Triệu Nguyễn Trung, Huỳnh Hồng Quang (2008), “Cập nhật các loài Fasciola trên Thế giới bằng kỹ thuật cổ điển và hiện đại”, Tạp chí Y dược học Quân sự, (33)2, tr. 98-103.
Tiếng Anh
26. Adachi S., Kotani K., Shimizu T., Tanaka K., Shimizu T., Okada K. (2005), “Asymptomatic fasciolasis. Department of General Internal Medicine, Tottori Central Prefectural Hospital”, Japan Intern Med, 44(9), pp. 1013-1015
27. Agatsuma T., Arakawa Y., Iwagami M., Honzako Y., Cahuaningsin U., Kang S.Y., Hong S.J. (2000), “Molecular evidence of natural hybridization between
Fasciola hepatica and F. Gigantica”, Parasitol Int, 49, pp. 231-238.
28. Amer S., Dar Y., Ichikawa M., Fukuda Y., Tada C., Itagaki T., Nakai Y. (2011), “Identification of Fasciola species isolated from Egypt based on sequence
analysis of genomic (ITS1 and ITS2) and mitochondrial (NDI and COI) gene markers”, Parasitol Int, 60(1), pp. 5 - 12.
29. Blair D., Agatsuma T., Watanobe T., Okamoto M., Ito A. (1997), “Geographical genetic structure within the human lung fluke Paragonimus westermani, detected from DNA Sequences”, Parasitology, 115, pp. 411-417.
30. Boore J. L. (1999), “Animal mitochondrial genomes”, Nucleic Acids Res, 27(8), pp. 1767-1178.
31. Dang T. T., Nawa Y. (2005), “Fasciola and Fascioliasis in Vietnam”, Asian Parasitol, 1, pp. 57-60.
32. Despommier D. D., Gwadz R. W., Hotez P. J. (1995), Fasciola hepatica (Linnaeus 1758), Parasitic Diseases, Springer, New York, NY.
33. Echenique-Elizondo M., Amondarain J., Liron de Robles C. (2005), “Fascioliasis an exceptional cause of acute pancreatilis”, JOP, 6(1), pp. 36- 9. 34. Fritzscha G., Schjegel M., Stadler P. F. (2006), “Alignments of mitochondrial
genome arrangements: applications to metazoan phylogeny”, J Theor Biol,
240(4), pp. 511-520.
35. Guarro J., Gené J., Stchigel A. M. (1999), “Review: Developments in fungal taxonomy”, Clin Microbiol Rev, 12(3), pp. 454-500.
36. Hashimoto K. T., Watanobe C., Liu C. X., Init I., Blair D., Ohnishi S., Agatsuma T. (1997), “Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanese
Fasciola species is F. gigantica”, Parasitol Res, 83, pp. 220-225.
37. Hu M., Gasser R. B. (2006), “Mitochondrial genomes of parasitic nematodes- progress and perspectives”, Trends Parasitol, 22(2), pp. 78-84.
38. Huang Y. W., He B., Wang C. R., Zhu X. Q. (2004), “Characterisation of Fasciola species from Mainland China by ITS-2 ribosomal DNA sequence”, Vet
Parasitol, 120, pp. 75-83.
39. Itagaki T., Kikawa M., Sakaguchi K., Shimo J., Terasaki K., Shibahara T., Fukuda K. (2005), “Genetic characterization of parthenogenetic Fasciola sp. in Japan on the basis of the sequences of ribosomal and mitochondrial DNA”,
Parasitolology, 131, pp. 679-685.
40. Itagaki T., Sakaguchi K., Terasaki K., Sasaki O., Yoshihara S., Van Dung T. (2009), “Occurrence of spermic diploid and aspermic triploid forms of Fasciola in Vietnam and their molecular characterization based on nuclear and mitochondrial DNA”, Parasitol Int, 58, pp. 81-85.
41. Itagaki T., Tsutsumi K. I. (1998), “Triploid form of Fasciola in Japan: genetic relationships between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica determined by
ITS-2 sequence of nuclear rDNA”, International Journal for Parasitology, 28,
pp. 777-781.
42. Jogen H., Brian P. (1994), The epidemiology, diagnosis and control of Helminth parasites of Ruminants, Hand bock, pp. 32-33.
43. Kaufmann J. (1996), Parasitic infection of domestic animal, Birkhauser verlag, Basel, Boston, Berlin, pp. 90-94.
44. Kendall S. B., et al. (1953), “Life-history of Fasciola gigantica Cobbold 1856”,
Nature, 171(4365), pp. 1164-1165.
45. Kramer F., Schnieder T. (1998), “Sequence heterogeneity in a repetitive DNA element of Fasciola”, Int J Parasitol, 28(12), pp. 1923-1929.
46. Le T. H., Blair D., Agatsuma T., Humair P. F., Campbell N.J., Iwagami M., Littlewood D. T., Peacock B., Johnston D. A., Bartley J., Rollinson D., Herniou E. A., Zarlenga D. S., McManus D. P. (2000), “Phylogenies inferred from mitochondrial gene orders-a cautionary tale from the parasitic flatworms”, Mol
Biol Evol,17(7), pp. 1123-1125.
47. Le T. H., De N. V., Agatsuma T., Blair D., Vercruysse J., Dorny P., Nguyen T. G. T., McManus D. P. (2007), “Molecular confirmation that Fasciola gigantica can undertake aberrant migrations in human hosts”, Journal of Clinical Microbiology, 45(2), pp. 648-650.
48. Le T. H., Van De N., Agatsuma T., Nguyen T. G. T., Nguyen Q. D., McManus D. P., Blair D. (2008), “Human fascioliasis and the presence of hybrid/ introgressed forms of Fasciola hepatica andFasciola gigantica in Vietnam”, Int J
Parasitol, 38, pp. 725-730.
49. Lotfy W. M., Brant S. V., DeJong R. J., Le T. H., Demiaszkiewicz A. (2008), “Evolutionary origins, diversification, and biogeography of liver flukes (Digenea, Fasciolidae)”, Am J Trop Med Hyg,79, pp. 248-255.
50. Marcilla A., Bargues M. D., Mas-Coma S. (2002), “Assay for the distinction between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica”, Mol Cell Probes, 16(5), pp. 327-333.
51. Mas-Coma S., Valero M. A., Bargues M. D. (2009), “Fasciola, lymnaeids and human fascioliasis with a global overview on disease transmission, epidemiology, evolutionary genectics, molecular epidemiology and control”,
Adv Parasitol, 69, pp. 41-146.
52. Mercer E., Dixon K. (1967), “The fine structure of the cystogenic cells of the cercaria of Fasciola hepatica L.”, Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie, 77(3), pp. 331-344.
53. Nguyen S. T., Nguyen D. T., Van Nguyen T., Huynh V. V., Le D. Q., Fukuda Y., Nakai Y. (2012), “Prevalence of Fasciola in cattle and of its intermediate
host Lymnaea snails in central Vietnam”, Trop Anim Health Prod, 44(8), pp. 1847-1853.
54. Nguyen T. G. T., De N. V., Vercruysse J., Dorny P., Le T. H. (2009), “Genotypic characterization and species identification of Fasciola spp. with implications regarding the isolatesinfecting goats in Vietnam”, Exp Parasitol,
123, pp. 354-361.
55. Nguyen T. G., Le T. H., Dao T. H., Tran T. L., Praet N., Speybroeck N.,