2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA
DNA tổng số của lá ngô được tách chiết theo quy trình của Rogers và Bendich [25]. 0,5 g lá tươi được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Sau đó, bột lá được chuyển vào ống ly tâm 1,5 mL chứa 0,5 mL đệm chiết (100 mM Tris-HCl pH8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA pH8,0, 2% CTAB, 0,2% β- mercaptoethanol) và đảo đều. Hỗn hợp dịch chiết được ủ ở 65°C trong 60 phút. Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và dịch ở pha trên chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Dung dịch phenol : choloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ thể tích 25 : 24 : 1) được bổ sung vào ống mẫu với tỷ lệ thể tích là 1:1, sau đó ly tâm 12.000 vịng/phút trong 20 phút ở 4°C. Dịch ở pha trên được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở 37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL. DNA được tủa bằng cách bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ trong 3 giờ ở -20°C. Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH 70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Bước rửa được thực hiện hai lần. Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5 phút và được hịa trong nước khơng chứa Dnase. DNA được bảo quản ở -20°C.
Plasmid được tách chiết từ 3 mL dịch nuôi khuẩn lạc đơn trong ống nghiệm chứa mơi trường lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp, ở nhiệt độ phù hợp (28°C đối với A. tumefaciens và 37°C đối với E. coli ), nuôi qua đêm với tốc độ lắc 200
vịng/phút. Đầu tiên, dịch ni khuẩn được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C để thu cặn tế bào. Sau đó, cặn tế bào được hịa tan trong 150 µL dung dịch I (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTA pH 8,0). Sau khi bổ sung 150 µL dung dịch II (0,2 M NaOH, 1% SDS) và đảo nhẹ 3 – 5 lần, cho 150 µL dung dịch III ( 3M CH3COOK, 11,5% CH3COOH) vào ống mẫu và đặt trên đá trong 5 phút. Ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch
trên và chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở 37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL. DNA được tủa bằng cách bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ trong 3 giờ ở -20°C. Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vịng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH 70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Bước rửa được thực hiện hai lần. Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5 phút và được hịa trong nước khơng chứa Dnase. DNA được bảo quản ở -20°C.