2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.9. Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A tumefaciens
Cây ngô chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng quy trình chuyển gen vào phôi ngô non trung gian qua vi khuẩn A. tumefaciens theo Frame và cộng sự
[14].
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn: Chuyển một khuẩn lạc A. tumefaciens chứa
plasmid quan tâm trên đĩa nuôi cấy vào 3 mL mơi trường YEP lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp và lắc 200 vịng/phút ở 28°C qua đêm. Dịch ni được làm mới trong 50 mL mơi trường YEP lỏng có kháng sinh thích hợp. Khi dịch ni đạt OD600 = 1, thu tế bào bằng cách ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong 15 phút. Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong môi trường lây nhiễm có bổ sung AS (acetyl syringone). Dịch huyền phù vi khuẩn có chỉ số OD600 = 0,5 được sử dụng để
- Chuẩn bị phôi non: Bắp ngô non được thu từ các cây ngô mẹ sau khi thụ phấn từ 9 - 13 ngày. Bắp ngô được khử trùng bề mặt bằng dung dịch NaOCl 5%. Ngay sau khi thu hái, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng và được lây nhiễm với dịch vi khuẩn có bổ sung AS nồng độ 100 µM trong 20 phút.
- Đồng nuôi cấy: Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy, đặt trong tối ở nhiệt độ 21°C trong 3 ngày.
- Nuôi phục hồi: Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường đồng nuôi cấy sang môi trường phục hồi, đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 7 ngày.
- Chọn lọc mô sẹo: Mô sẹo tạo thành từ phôi non được cấy chuyển từ môi trường phục hồi sang mơi trường chọn lọc 1 có bổ sung kháng sinh hygromycin (1,5 mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 14 ngày. Sau đó, các mơ sẹo tiếp tục được chuyển sang mơi trường chọn lọc 2 có nồng độ kháng sinh hygromycin (3mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28oC trong 14 ngày.
- Tạo chồi: Các mơ sẹo phơi hố tạo thành trên môi trường chọn lọc được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 1, khơng có chất kích thích sinh trưởng, đặt trong tối ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngày. Các mô sẹo phôi hố này tiếp đó được cấy chuyển sang mơi trường tái sinh 2 khơng bổ sung kháng sinh, đặt ngồi sáng ở nhiệt độ 25°C, liên tục chuyển môi trường tái sinh 2 cho đến khi các mơ sẹo phơi hố này tạo thành các chồi.
- Tái sinh cây chuyển gen hồn chỉnh: Chồi tái sinh trong mơi trường tái sinh được cấy chuyển sang mơi trường tạo cây hồn chỉnh ở điều kiện sáng 25°C, trong khoảng 10 - 20 ngày.
- Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường tái sinh khi có khoảng 2 - 3 lá được chuyển ra trồng trên giá thể trấu hun trong hai tuần, sau đó được chuyển ra trồng trên đất.