KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN

KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

3.1.1. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao

3.1.1.1. Ảnh hưởng của các loại mồi bẫy khác nhau

Nấm Phytophthora là loại nấm sinh dưỡng (biotroph) điển hình, hầu như

không tồn tại dưới dạng hoạt động trong mô chết nên khả năng phân lập nấm trực tiếp từ mơ bệnh trên mơi trường chọn lọc nhìn chung rất khó thành công. Mặt khác, nấm Phytophthora thường mọc chậm trên môi trường, do vậy dễ bị cạnh tranh bởi các loài nấm khác. Chính vì vậy, trong phân lập nấm Phytophthora người ta thường sử dụng mồi bẫy mẫn cảm để bẫy nấm.

Nhằm nghiên cứu vật liệu bẫy thích hợp đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao, các loại mồi bẫy là quả ca cao, đu đủ, táo, lê còn xanh được sử dụng trong thí nghiệm. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của vật liệu bẫy đến khả năng bẫy nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao (Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

TT Vật liệu bẫy Tổng số quả để bẫy

Tỷ lệ mồi bẫy bẫy đƣợc nấm

Phytophthora(%)

Tỷ lệ mồi bẫy phân lập đƣợc

Phytophthora (%)

1 Quả ca cao xanh 50 78,0 26,0

2 Quả táo tây 50 24,0 10,0

3 Quả đu đủ xanh 50 22,0 8,0

4 Quả lê xanh 50 14,0 4,0

Sử dụng mồi bẫy quả ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp. cao nhất là 78%, cho tỷ lệ phân lập cao nhất là 26%. Các loại quả khác cũng bẫy được nấm Phytophthora sp. nhưng cho tỷ lệ thấp hơn nhiều.

Nguyên tắc của phương pháp bẫy là lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc của loài Phytophthora đối với mô ký chủ còn sống, các cây ký chủ này sẽ được coi là môi trường chọn lọc, vết bệnh do nấm Phytophthora gây ra sẽ được phân lập trên môi trường nhân tạo chọn lọc. Đặc điểm vết bệnh trên vật liệu bẫy (các loại quả) do nấm Phytophthora gây nên thường rắn, cứng dễ nhận biết, còn những vết hoại do Pythium và vi khuẩn gây nên thường thối mềm, nhũn.

Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Drenth và cs (2004) [31] khi sử dụng quả ca cao xanh làm mồi bẫy, vết bệnh đặc trưng thường xuất hiện sau 1 - 3 ngày, có hiệu quả trong việc bẫy và phân lập nấm

Phytophthora.

3.1.1.2. Khả năng ức chế của một số thuốc hoá học đối với nấm phụ sinh trên mô bệnh

Một trong những nguyên lý cơ bản của sự phân lập chọn lọc là sử dụng một hoặc nhiều hóa chất trong môi trường để ngăn cản sự phát triển của cả nấm và vi khuẩn tạp nhiễm, nhưng ít hoặc không ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm

Phytophthora. Vì vậy, chúng tơi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu khả năng ức

chế của một số loại thuốc hóa học với nấm và vi khuẩn tạp nhiễm nhằm mục đích lựa chọn được các loại thuốc hóa học với nồng độ phù hợp để sử dụng trong môi trường phân lập nấm Phytophthora cho hiệu quả phân lập cao.

a. Khả năng ức chế của thuốc Ben lat 80WP

Thuốc Benlat 80WP có hoạt chất Benomyl 95% là một thuốc trừ nấm có thể tiêu diệt được nhiều loại nấm đất (nhưng ít có ảnh hưởng lên

Phytophthora), tuy nhiên đối với các loài nấm Phytophthora khác nhau, các liều lượng thuốc có ảnh hưởng đến khả năng phát triển của chúng. Việc tìm hiểu nồng độ của thuốc là bao nhiêu cho phù hợp để vừa không ức chế được sự phát triển của nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao, lại có hiệu quả ức chế các loại nấm khác là rất quan trọng. Chúng tôi sử dụng thuốc Ben lat 80WP với 4 nồng độ khác nhau trong thí nghiệm. Trong các công thức đều có sử dụng thuốc kháng sinh Rifampicin 30µg/ml trong mơi trường V8. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của thuốc Benlat 80WP đến khả năng phân lập nấm

Phytophthora sp. gây bệnh thối đen quả ca cao (Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

TT Cơng thức thí nghiệm Tổng số mồi bẫy Tỷ lệ phân lập đƣợc (%) Phytophthora Fusarium Nấm khác 1 Ben lat 80WP (40µg/ml) 60 0,0 0,0 0,0 2 Ben lat 80WP (30µg/ml) 60 0,0 0,0 45,0 3 Ben lat 80WP (20µg/ml) 60 40,0 20,0 40,0 4 Ben lat 80WP (10µg/ml) 60 15,0 53,3 31,7

5 MT V8 (không có thuốc) 60 0,0 68,3 31,7

Kết quả cho thấy thuốc Ben lat 80WP có khả năng ức chế một số nấm phụ sinh khác trên mô bệnh, đặc biệt là nấm Fusarium, tạo điều kiện cho nấm Phytophthora có khả năng mọc trên môi trường cao hơn. Ben lat 80WP dùng với

liều lượng 20µg/ml cho tỷ lệ phân lập Phytophthora đạt cao nhất là 40,0%. Ở liều

lượng quá cao 30 - 40 µg/ml, thuốc ức chế sự phát triển của nấm Fusarium đồng thời cũng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora. Ở liều lượng 10µg/ml có khả năng ức chế thấp đối với nấm Fusarium, số lượng mẫu bị nhiễm tạp nấm Fusarium nhiều, khả năng phân lập được nấm Phytophthora thấp hơn chỉ đạt 15,0%. Trong

điều kiện phân lập trực tiếp từ mô cây bệnh có thể sử dụng thuốc Ben lat 80WP kết hợp với một số hoá chất khác sẽ tăng hiệu quả phân lập cao hơn.

b. Khả năng ức chế của thuốc Tachigaren 30L (Hymexazol 30%)

Thuốc Tachigaren 30L (hoạt chất Hymexazol 30%) của công ty Sankyo Agroco với giá thành rẻ và dễ tìm kiếm được dùng để tiến hành thí nghiệm khả năng phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao. Hoạt chất

hymexazol ức chế sự phát triển của nhiều loài nấm Pythium, những loài nấm này

tồn tại trong đất xung quanh vùng rễ và rễ của nhiều loại cây trồng. Hợp chất kháng nấm pimaricin hoặc benomyl sử dụng trong môi trường phân lập nấm Phytophthora đều không có khả năng ức chế được nấm Pythium, trong khi đó khả năng mọc của

nấm Pythium trên môi trường nhanh hơn nấm Phytophthora, sẽ là trở ngại lớn cho

Tiến hành thử nghiệm thuốc Tachigaren 30L ở 4 nồng độ khác nhau, trong các công thức đều có sử dụng thuốc kháng sinh Rifampicin 30µg/ml trong mơi trường V8. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của thuốc Tachigaren 30L đến khả năng phân lập nấm

Phytophthora sp. gây bệnh thối đen quả ca cao (Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

TT Cơng thức thí nghiệm Tổng số mồi bẫy

Tỷ lệ phân lập đƣợc (%)

Phytophthora Pythium Nấm khác

1 Tachigaren 30L, (0,5 µl/ml) 60 0,0 0,0 0,0

2 Tachigaren 30L, ( 0,4 µl/ml) 60 10,0 0,0 31,7

3 Tachigaren 30L (0,3 µl/ml) 60 18,3 0,0 50,0

4 Tachigaren 30L (0,2 µl/ml) 60 5,0 10,0 85,0

5 MT V8 (không có thuốc) 60 0,0 11,7 88,3

Thuốc Tachigaren 30L có khả năng ức chế được nấm Pythium sp. trên môi

trường. Tuy nhiên đối với quả ca cao bị thối đen, khả năng tạp nhiễm nấm Pythium thấp. Thuốc Tachigaren 30L sử dụng ở liều lượng 0,3 µl/ml cho tỷ lệ phân lập được nấm Phytophthora sp. cao nhất (18,3%), ở liều lượng 0,5 µl/ml khơng có khả năng phân lập được nấm Phytophthora, do ở liều lượng cao Tachigaren ức chế hoàn toàn nấm Pythium, đồng thời sợi nấm Phytophthora cũng bị ức chế hoàn toàn. Ở liều lượng 0,2 µl/ml số mẫu bị tạp nhiễm nhiều, số mẫu phân lập được nấm

Phytophthora chỉ đạt 5,0%.

Hymexazol là hóa chất chọn lọc có hiệu quả cho sự phân lập của một số loài Phytophthora, tuy nhiên nó vẫn có độc tính cao với một số loài Phytophthora nhất định và ngược lại khơng kìm hãm tất cả các loài Pythium.

Hymexazol không ức chế được sự phát triển của nấm Pythium proliferum và Pythium vexans. Hymexazol kìm hãm rất mạnh đối với sự phát triển của nấm Phytophthora infestans, Phytophthora phaseoli, Phytophthora porri, Phytophthora syringae, làm chậm sự phát triển của nấm Phytophthora hibernalis và Phytophthora lateralis, nhưng ảnh hưởng nhẹ đối với sự mọc của nấm Phytophthora fragariae và Phytophthora ilicis và kìm hãm khơng nhiều đối với

nấm Phytophthora cactorum, Phytophthora pseudotsugae [48]. Vì vậy, việc

nghiên cứu phương pháp phân lập đem lại hiệu quả cao cần được nghiên cứu cụ thể cho từng loài và từng loại cây trồng.

3.1.1.3. Khả năng ức chế của thuốc kháng sinh RH đối với vi khuẩn tạp nhiễm trong phân lập nấm Phytophthora

Một trong những khó khăn lớn nhất trong phân lập là do sự tạp nhiễm của vi khuẩn trên mô bệnh và môi trường. Việc nghiên cứu một số môi trường có chứa các loại kháng sinh hạn chế sự phát triển của vi khuẩn tạp nhiễm là rất cần thiết.

Theo Masago và cs (1977) [48], Rifampicin là kháng sinh có khả năng ức chế được vi khuẩn Gram âm. Hiện nay môi trường PSM là môi trường chọn lọc cho phân lập nấm Phytophthora có chứa chất kháng sinh Rifampicin kết hợp với thuốc diệt nấm Hymexazol và Pimaricin.

Thuốc kháng sinh RH dạng viên nén có chứa hoạt chất Rifampicin 150mg của công ty dược phẩm Minh Tiến được sử dụng để tìm hiểu khả năng ức chế của thuốc với vi khuẩn tạp nhiễm trong quá trình phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao. Thí nghiệm được tiến hành với 5 liều lượng khác nhau trên môi trường phân lập V8, kết quả được ghi nhận ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thuốc kháng sinh RH đến khả năng phân lập nấm

Phytophthora sp. gây bệnh thối đen quả ca cao (Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

TT Cơng thức thí nghiệm Tổng số

mồi bẫy

Tỷ lệ phân lập đƣợc (%)

1 Thuốc RH liều lượng 50 µg/ml 60 13,3

2 Thuốc RH liều lượng 40 µg/ml 60 35,0

3 Thuốc RH liều lượng 30 µg/ml 60 71,7

4 Thuốc RH liều lượng 20 µg/ml 60 41,7

5 Thuốc RH liều lượng 10 µg/ml 60 6,7

6 Đối chứng (MT V8 không thuốc) 60 0,0

Thuốc RH có khả năng ức chế được vi khuẩn tạp nhiễm trên môi trường và cho khả năng phân lập được nấm Phytophthora cao. Tuy nhiên ở liều lượng

khác nhau cho khả năng phân lập được nấm Phytophthora khác nhau. Thuốc RH liều lượng 40 - 50 µg/ml có khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, nhưng cũng ức chế một phần sự phát triển của sợi nấm Phytophthora nên cho

khả năng phân lập được nấm Phytophthora thấp (13,3 - 35,0%). Ở liều lượng 20 - 30 µg/ml có khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, số mồi bẫy phân lập đạt cao nhất: 41,7 - 71,7%, ở liều lượng này sợi nấm Phytophthora phát triển rất tốt. Ở liều lượng 10 µg/ml khơng ức chế được hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, vì vậy số mồi bẫy bị vi khuẩn mọc lấn át chiếm tỷ lệ cao, khả năng phân lập được nấm bệnh thấp hơn rất nhiều (6,7%).

Tổng hợp các kết quả nghiên cứu tại mục 3.1.1.2 và 3.1.1.3, chúng tôi lựa chọn thuốc Ben lat 80WP (hoạt chất Benomyl 95%) nồng độ 20 µg/ ml; thuốc Tachigaren 30L (hoạt chất Hymexazol 30%) nồng độ 0,3 µl/ ml; thuốc kháng sinh RH (hoạt chất Rifampicin) nồng độ 20 µg/ ml được sử dụng trong môi trường để phân lập nấm Phytophthora nhằm đạt hiệu quả cao.

3.1.2. Lây bệnh nhân tạo để xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao

Theo nguyên tắc Robert Koch, một đối tượng vi sinh vật khi phân lập được, để xác định có phải là tác nhân gây bệnh hay khơng thì cần phải tiến hành lây bệnh nhân tạo và tái phân lập trở lại.

Từ 100 mẫu quả ca cao bị bệnh thối đen thu thập được ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nơng, đề tài đã tiến hành phân lập được 20 chủng nấm Phytophthora. Chúng tôi tiến hành lây bệnh nhân tạo cho quả ca cao

không bị bệnh bằng 20 chủng nấm phân lập được. Mỗi chủng nấm làm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 2 quả, mỗi quả lây 1 vị trí. Theo dõi các ngày sau lây nhiễm, kết quả thu được ở bảng 3.5.

Nấm Phytophthora là loài nấm ký sinh chuyên tính, không sống hoại sinh,

kết quả lây bệnh ở bảng trên cho thấy các mẫu lây nhiễm đạt tỷ lệ 100%. Thời gian tiềm dục của nấm gây bệnh thối đen trên quả ca cao ngắn từ 24 - 36h. Sau khi lây nhiễm với thời gian từ 24- 36h quả bắt đầu biểu hiện triệu chứng bệnh, thời gian thay đổi tùy theo quả non hay quả già. Các mẫu bệnh sau khi lây nhiễm được tái phân lập, tỷ lệ phân lập lại thu được chủng nấm ban đầu, với tỷ lệ đạt 100%.

Bảng 3.5. Kết quả lây nhiễm nhân tạo các chủng nấm Phytophthora sp. gây bệnh thối đen quả ca cao (Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

Ký hiệu mẫu Số quả lây nhiễm Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thời gian tiềm dục của bệnh (giờ) Triệu chứng bệnh sau lây nhiễm Tỷ lệ mẫu tái phân lập (%) CCDL 1.3 6 100 24h

Mô vỏ quả biến màu đen, sau đó vỏ quả thối và lan dần toàn quả, nấm xâm nhập vào ruột quả và hạt gây biến màu

100 CCDL 2.3 6 100 24 Như trên 100 CCDL 2.4 6 100 24 Như trên 100 CCDL 3.6 6 100 24 Như trên 100 CCDL 4.2 6 100 24 Như trên 100 CCDL 5.1 6 100 24 Như trên 100 CCDL 11.4 6 100 24 Như trên 100 CCDL 13.2 6 100 36 Như trên 100 CCDL 15.1 6 100 36 Như trên 100 CCDL 16.1 6 100 24 Như trên 100 CCDN 3 6 100 24 Như trên 100 CCDN 4 6 100 36 Như trên 100 CCDN 7 6 100 24 Như trên 100 CCDN 8 6 100 24 Như trên 100 CCBP 2 6 100 24 Như trên 100 CCBP 3 6 100 24 Như trên 100 CCBP 5 6 100 24 Như trên 100 CCBP 10.1 6 100 24 Như trên 100 CCBP 10.2 6 100 24 Như trên 100 CCBP 10.3 6 100 24 Như trên 100 ĐC (nước

3.1.3. Xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Sau khi lây bệnh nhân tạo thành công, chọn 20 chủng nấm Phytophthora sp. này để xác định loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

3.1.3.1. PCR và giải trình tự vùng ITS

Tất cả 20 chủng nấm được chiết DNA, thực hiện PCR và giải trình tự. Sau khi lắp ráp, tất cả 20 chủng đều có kích thước đoạn đọc được từ 729 - 782, tương ứng với sản phẩm PCR (bảng 3.6). Đoạn đọc được của tất cả 20 chủng đều chứa vùng ITS4 và ITS5 cần cho phân tích.

Bảng 3.6. Kết quả giải trình tự các chủng Phytophthora phân lập từ ca cao

(Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 2013)

STT Ký hiệu chủng Mã Sequencing Mồi giải trình tự Sản phẩm cuối (bp) 1 CCBP10.1 CCBP10-1_ITS4 ITS4 781 2 CCBP10.1 13COZAA003 ITS5 3 CCBP10.2 13D1ZAB010 ITS4 782 4 CCBP10.2 13D1ZAB011 ITS5 5 CCBP10.3 CCBP10-3_ITS4 ITS4 750 6 CCBP10.3 13COZAA004 ITS5 7 CCBP2 CCBP2_ITS4 ITS4 729 8 CCBP2 13COZAA000 ITS5 9 CCBP3 CCBP3_ITS4 ITS4 781 10 CCBP3 13COZAA001 ITS5 11 CCBP5 CCBP5_ITS4 ITS4 756 12 CCBP5 13COZAA002 ITS5 13 CCDN3 CCDN3_ITS4 ITS4 757 14 CCDN3 13COZAA005 ITS5 15 CCDN4 13D1ZAB008 ITS4 776 16 CCDN4 13D1ZAB009 ITS5 17 CCDN7 CCDN7_ITS4 ITS4 792 18 CCDN7 13COZAA006 ITS5 19 CCDN8 CCDN8_ITS4 ITS4 748 20 CCDN8 13COZAA007 ITS5 21 CCDL1.3 13D1ZAB004 ITS4 783 22 CCDL1.3 13D1ZAB005 ITS5

STT Ký hiệu chủng Mã Sequencing Mồi giải trình tự Sản phẩm cuối (bp) 23 CCDL11.4 DL11-4_ITS4 ITS4 710 24 CCDL11.4 13COZAA013 ITS5 25 CCDL13.2 13D1ZAB006 ITS4 775 26 CCDL13.2 13D1ZAB007 ITS5 27 CCDL15.1 DL15-1_ITS4 ITS4 736 28 CCDL15.1 13COZAA014 ITS5 29 CCDL16.1 DL16-1_ITS4 ITS4 764 30 CCDL16.1 13COZAA015 ITS5 31 CCDL2.3 DL2-3_ITS4 ITS4 782 32 CCDL2.3 13COZAA008 ITS5 33 CCDL2.4 DL2-4_ITS4 ITS4 779 34 CCDL2.4 13COZAA009 ITS5 35 CCDL3.6 DL3-6_ITS4 ITS4 761 36 CCDL3.6 13COZAA010 ITS5 37 CCDL4.2 DL4-2_ITS4 ITS4 773 38 CCDL4.2 13COZAA011 ITS5 39 CCDL5.1 DL5-1_ITS4 ITS4 751 40 CCDL5.1 13COZAA012 ITS5

Tất cả 20 chủng được giải trình tự đều có đặc điểm giống nhau như sau: - Tất cả 20 chủng được giải trình tự với mồi ITS5 đều có khoảng 650 nucleotide phía bên trái có chất lượng rất tốt, phần còn lại có chất lượng rất xấu (nhiễu).

- Tất cả 20 chủng được giải trình tự với mồi ITS4, trái lại, đều có khoảng 100 nucleotide phía bên phải có chất lượng rất tốt, phần còn lại có chất lượng rất xấu (nhiễu).

- Đối với tất cả 20 sản phẩm PCR, vị trí phân chia 2 vùng có trình tự chất lượng tốt - xấu của mỗi cặp giải trình tự đều giống nhau như minh họa đối với chủng Cacao-BP5 ở hình 3.1.

Hiện tượng này xuất hiện khi giải trình tự trực tiếp một sản phẩm PCR mà trên sản phẩm này chứa vị trí có trình tự khơng đồng nhất. Hậu quả, DNA polymerase sẽ khơng thể đọc đúng trình tự tính từ phía hạ lưu của vị trí không đồng nhất.

Khơng giống như nấm túi, nấm nỗn oomyces như Phytophthora có bộ gen

lưỡng bội. Vị trí không đồng nhất có thể được xem là một locus dị hợp tử, hậu quả