Phƣơng pháp nghiên cứu

CHƢƠNG II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ

- Lấy mẫu ở các cửa hàng cạnh trƣờng học , ở chợ, đại lý, cƣ̉a hàng, siêu thị ta ̣i khu vƣ̣c Tp. Hải Dƣơng.

- Mỗi mẫu lấy khoảng 200 – 500 gam đối với mẫu rắn vào túi polyethylen khơ, sạch, đóng kín, và khoảng 500 ml đối với mẫu lỏng cho vào chai nhựa điền đầy đủ thơng tin chuyển về phịng thí nghiệm phân tích.

- Đối với mẫu rắn, mẫu đƣợc nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu đến khi nhỏ mịn, đồng đều. Đồng nhất xong cho vào túi kín, tránh ẩm. Đối với mẫu lỏng, mẫu đƣợc lắc kỹ trƣớc khi đem phân tích.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích

2.3.2.1. Phương pháp xử lý mẫu

Nguyên tắc: Các nghiên cứu đƣợc xây dựng dựa trên TCVN 8471 : 2010 nhƣng có sự điều chỉnh trong q trình xử lý mẫu và điều kiện chạy máy HPLC. Xử lý mẫu theo TCVN 8471 : 2010: Mẫu đƣợc chiết hoặc đƣợc pha lỗng với nƣớc. Dung dịch mẫu có nồng độ chất tạo ngọt cao đƣợc tinh sạch trên cột chiết pha rắn hoặc bằng thuốc thử Carrez, nếu cần. Các chất tạo ngọt với nồng độ cao có trong dung dịch mẫu thử đƣợc tách trên cột sắc kí pha đảo của HPLC và đƣợc xác định bằng phép đo phổ tại bƣớc sóng 220 nm.[18]

Sơ đồ 2.1. Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010

2ml Dung dịch Carrez 1 Lắc vortex 2ml Dung dịch Carrez 2 Lắc vortex vortex

Mẫu cân khoảng (2-10g) hoặc (5-20ml)

HPLC + 30ml H2O Bình định mức 100 ml Định mức bằng nƣớc Lọc qua giấy lọc Đồng nhất mẫu

Rung siêu âm

2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu các điều kiện phân tích

Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu để xác định đồng thời hàm lƣợng acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam đƣợc thực hiện theo các trình tự sau:

 Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký trên máy HPLC

- Chọn detector: Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại rất tốt do trong cấu tạo phân tử của các chất phân tích này đều có liên kết . Vì vậy, detector DAD (diode array detector) và detector UV đều có thể đƣợc sử dụng cho việc định tính và định lƣợng các chất trên. Nhƣng detector DAD cho phép đo đồng thời tại nhiều bƣớc sóng (đo phổ UV) trong quá trình sắc ký. Để thuận lợi cho cơng việc chung của phịng nên chúng tơi lựa chọn detector DAD để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

- Chọn bƣớc sóng: Dựa vào tính chất của chất cần phân tích và điều kiện trang thiết bị của phịng thí nghiệm để lựa chọn detector phù hợp, dùng detector vừa lựa chọn để qt phổ và tìm bƣớc sóng tối ƣu cho mỗi chất cần phân tích.

- Chọn pha động: Có hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp.

Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc dùng trong sắc ký pha liên kết ngƣợc. Loại pha động này phù hợp với chất phân tích là chất phân cực yếu.

- Chƣơng trình gradient: Sự thay đổi thành phần pha động diễn ra theo thời gian - Ảnh hƣởng của pH của pha động: Các chất phân tích đều là những acid hoặc muối của dạng acid nên pH của pha động sẽ quyết định chất phân tích trong cột tồn tại ở dạng acid hay dạng muối. Khi thay đổi pH sẽ thay đổi thời gian lƣu của chất phân tích trên cột.

 Tối ƣu hóa quy trình xử lý mẫu

- Khảo sát thời gian rung siêu âm: Q trình chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu thực hiện chủ yếu thơng qua q trình rung siêu âm. Vì vậy q trình chiết có

triệt để hay không phụ thuộc rất lớn vào thời gian rung siêu âm. Chúng tôi khảo sát thời gian rung siêu âm từ 0 phút đến 60 phút.

- Khảo sát lƣợng MeOH thêm vào: Tùy từng loại thực phẩm, nhà sản suất có thể thêm chất phụ gia ở dạng acid hay dạng muối. Nếu chất phụ gia đƣợc thêm vào ở dạng muối, chỉ cần sử dụng nƣớc để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu. Nếu chất phụ gia thêm vào ở dạng acid, khó tan trong nƣớc. Cho MeOH vào mẫu để chiết dạng acid trƣớc rồi thêm nƣớc để chiết nốt dạng muối của chất phân tích (nếu cịn). Lƣợng MeOH cho vào xử lý mẫu đƣợc khảo sát từ 2 ml đến 10 ml.

 Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích

- Đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký: Chuẩn bị một dung dịch chuẩn có nồng độ xác định, tiến hành phân tích trên HPLC lặp lại 6 lần. Xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối của các thơng số: thời gian lƣu, diện tích pic.

- Độ chọn lọc/ đặc hiệu

Tính đặc hiệu nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác. Tính đặc hiệu liên quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích.

Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc xác định một số hay nhiều chất phân tích chung một quy trình. Nếu chất cần phân tích phân biết rõ với các chất khác thì phƣơng pháp phân tích có tính chọn lọc.

Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn.

+ Hệ số chọn lọc α (selectivity factor), còn gọi là hệ số tách: α = ' '

RA RB

t t

Theo qui ƣớc, B là chất bị lƣu giữ mạnh hơn A vì vậy α ln ln lớn hơn 1. α cịn đƣợc gọi là độ lƣu giữ tỷ đối (relative retention).

Để tách riêng hai chất, cần có α > 1, thƣờng chọn α trong khoảng 1,05 đến 2,0. α càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, với α quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài.

+ Độ phân giải: Độ phân giải (RS) là đại lƣợng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký. RS = ) ( 2 / 1 B A RA RB W W t t  

WA, WB là chiều rộng đáy pic của các chất 1 và 2

tRA, tRB là thời gian lƣu thực của các chất 1 và 2

Rs = 0,75 hai pic khơng tách tốt, cịn xen phủ nhau nhiều.

Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt,còn xen phủ nhau 4%

Rs =1,5 hai pic tách gần hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)

- Khoảng tuyến tính

Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn với nồng độ của chất đó.

Phƣơng trình hồi quy tuyến tính yaxb

Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn x là nồng độ chất khảo sát

Sau khi xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn và xác định hệ số hồi quy tƣơng quan(R): hệ số tƣơng quan hồi quy, R phải đạt theo yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định đƣợc nhƣng không nhất thiết phải định lƣợng đƣợc trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Trong sắc ký LOD có thể đƣợc xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3).

Giới hạn định lƣợng LOQ là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chụm nhận đƣợc. Trong sắc ký LOQ có thể đƣợc xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10). Có thế tính LOQ theo LOD theo cơng thức: LOQ = 10/3 * LOD.

- Độ chụm (độ lặp lại)

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích đƣợc áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu. Độ lặp lại đƣợc thể hiện bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần. Tính độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% của hàm lƣợng chất phân tích. Các cơng thức tính tốn nhƣ sau:

Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại. + Giá trị trung bình :     n 1 i i x n 1 x

Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm.

+ Độ lệch chuẩn : 1 n ) x x ( SD 2 n 1 i i     

+ Độ lệch chuẩn tƣơng đối :

100 X SD

RSD  

So sánh RSD(%) tính đƣợc so với RSD(%) cho phép ở nờng đơ ̣ chất tƣơng ƣ́ng theo AOAC. RSD(%) tính đƣợc khơng đƣợc lớn hơn trị giá trong bảng ở hàm lƣợng chất tƣơng ứng, độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích. Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (khơng chụm) nghĩa là RSD càng lớn. Mối liên quan giữa nồng độ chất phân tích và RSD (%) đƣợc thể hiện trong phụ lục 1. [9]

Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực (true value) hoặc đƣợc chấp nhận thực (accepted value).

- Độ thu hồi : Độ thu hồi đƣợc xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn. Lƣợng

chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi (R%) đƣợc tính nhƣ sau:   100 C C C % R c m c m    

Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ trong mẫu

Cc: Nồng độ chuẩn thêm

Sau khi tính độ thu hồi , so sánh kết quả tính đƣợc với các giá trị cho bởi trong phụ lục 2. Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau . Thông thƣờng đô ̣ thu hồi tính đƣợc phải nằm trong khoảng cho phép của AOAC ở nồng đô ̣ chất tƣơng ƣ́ng. Mối liên quan giữa nồng độ chất phân tích và độ thu hồi (%) đƣợc thể hiện trong phụ lục 2.

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu :

- Tính tốn kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel

- Tính tốn thời gian lƣu, diện tích peak, chiều cao peak và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng phần mềm của thiết bị.

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích 3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích

3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích

3.1.1.1. Lựa chọn detector

Xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các chất đang nghiên cứu: sử dụng detector DAD để quét tìm, với khoảng quét phổ là 190 ÷ 400 nm. Các chất đều đƣợc pha với nồng độ 10 ppm. Xác định đƣợc bƣớc sóng hấp thụ cực đại của sacchari và aspartam là 210 nm, acid benzoic là 198 nm và 226 nm, acid sorbic 254nm. Hình ảnh quét phổ của saccharin và aspartam thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam

Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic

Hình ảnh quét phổ của acid sorbic thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic

Dựa vào kết quả quét phổ chúng tơi lựa chọn bƣớc sóng 210 nm để xác định đồng thời saccharin và aspartam, bƣớc sóng 226 nm để xác định acid benzoic và bƣớc sóng 254 nm để xác đinh acid sorbic.

3.1.1.2 Lựa chọn cột tách

Cột tách là trái tim của hệ thống HPLC, nó quyết định q trình tách có độ phân giải tốt hay khơng. Căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích để lựa chọn cột tách phù hợp.

Do cấu trúc phân tử saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic là chất phân cực yếu. Vì vậy, để tách đƣợc các chất này nên chọn pha tĩnh là pha ngƣợc. Mặt khác, sử dụng chất nhồi pha ngƣợc thì hệ dung mơi là những chất phân cực nên kinh tế hơn, ổn định và không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ ẩm nhƣ chất nhồi củ a pha thƣờng. [6], [7]

Sắc đồ hỗn hợp các chất đƣợc phân tích bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) đƣợc thể hiện ở hình 3.4

Hình 3.4. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm)

Cột C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) có hình ảnh pic tách tốt, ít dỗng, nhọn và cân đối. Thích hợp cho phân tích đƣợc nhiều chất, để thuận tiện cho cơng việc chung của phịng phân tích, chúng tơi chọn sử dụng cột Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.1.3. Lựa chọn pha động

Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký. Thành phần pha động ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả tách sắc ký.

Trong sắc ký pha đảo, dung mơi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết, có thể sử dụng khá nhiều dung môi. Tuy nhiên, kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và nƣớc đƣợc lƣ̣a cho ̣n nhiều . Bên ca ̣nh đó , một số loại đệm (đệm phosphat, đệm acetat…) cũng là dung môi hay đƣợc sƣ̉ du ̣ng, những dung môi này đem la ̣i hiê ̣u quả cao , chi phí rẻ. [6], [7], [13], [15]. Độ phân cực của một số dung môi dùng làm pha động đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3.2: Tính chất của 1 sớ loại dung mơi dùng làm pha động

Để tách saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic ra khỏi các chất cản trở trong nền mẫu và định lƣợng nó dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực. Dựa trên độ phân cực của các dung mơi ở bảng 3.2 có thể chọn dung mơi có độ phân cực phù hợp. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát pha động gồm đệm phosphat (KH2PO4), methanol (MeOH), Acetonitrile (ACN) với tỉ lệ thể tích khác nhau theo phƣơng pháp đẳng dòng.

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thành phần pha động đến diện tích pic và thời gian lƣu đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic

Thành phần pha động % K2HPO4 95 90 85 80 75 70 90 80 70 ACN 5 10 15 20 25 30 0 0 0 MeOH 0 0 0 0 0 0 10 20 30

Thời Gian Lƣu (phút) Saccharin 9,40 5,04 3,31 2,77 2,68 2,90 9,06 4,60 3,16 Aspartam 77,1 21,7 8,36 4,41 3,02 3,86 97,6 31,5 13,4 A. Benzoic 30,7 15,9 9,38 6,40 4,83 5,04 32,4 16,9 9,65 A. Sorbic 54,5 25,7 14,2 8,98 6,30 6,28 60,7 28,3 14,6 Kết quả thực nghiệm cho thấy: Chế độ chạy sắc ký pha động thành phần không đổi (isocratic) với các tỷ lệ khác nhau của thành phần pha động thì khi giảm tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, thời gian lƣu giữ của một số chất phân tích trên cột giảm, chúng ra sớm nên rất dễ lẫn với tạp chất khi phân tích mẫu thực tế. Khi tăng tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, các chất phân tích ra muộn, đặc biệt là aspartam bị doãng pic. Nhƣ vậy sẽ làm giảm độ nhạy của phƣơng pháp phân tích. Sắc đồ hỗn hợp các chất phân tích với thành phần pha động KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v) tại bƣớc sóng 210nm, 226nm và 254nm đƣợc thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích, thành phần pha động KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm.

Qua kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy: việc tách và định lƣợng các chất theo chế độ đẳng dịng là khơng phù hợp với thực tế u cầu phân tích (trong cùng một tỷ lệ dung mơi, có chất thời gian lƣu q ngắn, có chất thời gian lƣu quá dài). Do đó chúng tơi chuyển sang chế độ gradient pha động. Bên cạnh đó, chúng tơi chọn hệ dung mơi là KH2PO4 : ACN vì khoảng cách thời gian lƣu của các chất khi chạy với hệ dung môi này khá đều, thuận tiện cho chế độ chạy gradient.

3.1.1.4. Khảo sát pH của pha động

Nếu pH của pha động cao, aspartam sẽ bị phân hủy. pH của pha động chỉ nên trong khoảng 2-7, vì lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của các hạt silic