3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích
3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích
3.1.1.1. Lựa chọn detector
Xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các chất đang nghiên cứu: sử dụng detector DAD để quét tìm, với khoảng quét phổ là 190 ÷ 400 nm. Các chất đều đƣợc pha với nồng độ 10 ppm. Xác định đƣợc bƣớc sóng hấp thụ cực đại của sacchari và aspartam là 210 nm, acid benzoic là 198 nm và 226 nm, acid sorbic 254nm. Hình ảnh quét phổ của saccharin và aspartam thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam
Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic
Hình ảnh quét phổ của acid sorbic thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic
Dựa vào kết quả quét phổ chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng 210 nm để xác định đồng thời saccharin và aspartam, bƣớc sóng 226 nm để xác định acid benzoic và bƣớc sóng 254 nm để xác đinh acid sorbic.
3.1.1.2 Lựa chọn cột tách
Cột tách là trái tim của hệ thống HPLC, nó quyết định q trình tách có độ phân giải tốt hay không. Căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích để lựa chọn cột tách phù hợp.
Do cấu trúc phân tử saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic là chất phân cực yếu. Vì vậy, để tách đƣợc các chất này nên chọn pha tĩnh là pha ngƣợc. Mặt khác, sử dụng chất nhồi pha ngƣợc thì hệ dung mơi là những chất phân cực nên kinh tế hơn, ổn định và không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ ẩm nhƣ chất nhồi củ a pha thƣờng. [6], [7]
Sắc đồ hỗn hợp các chất đƣợc phân tích bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) đƣợc thể hiện ở hình 3.4
Hình 3.4. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm)
Cột C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) có hình ảnh pic tách tốt, ít dỗng, nhọn và cân đối. Thích hợp cho phân tích đƣợc nhiều chất, để thuận tiện cho công việc chung của phịng phân tích, chúng tơi chọn sử dụng cột Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.3. Lựa chọn pha động
Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký. Thành phần pha động ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả tách sắc ký.
Trong sắc ký pha đảo, dung mơi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết, có thể sử dụng khá nhiều dung môi. Tuy nhiên, kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và nƣớc đƣợc lƣ̣a cho ̣n nhiều . Bên ca ̣nh đó , một số loại đệm (đệm phosphat, đệm acetat…) cũng là dung môi hay đƣợc sƣ̉ du ̣ng, những dung môi này đem la ̣i hiê ̣u quả cao , chi phí rẻ. [6], [7], [13], [15]. Độ phân cực của một số dung môi dùng làm pha động đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tính chất của 1 sớ loại dung mơi dùng làm pha động
Để tách saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic ra khỏi các chất cản trở trong nền mẫu và định lƣợng nó dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực. Dựa trên độ phân cực của các dung môi ở bảng 3.2 có thể chọn dung mơi có độ phân cực phù hợp. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát pha động gồm đệm phosphat (KH2PO4), methanol (MeOH), Acetonitrile (ACN) với tỉ lệ thể tích khác nhau theo phƣơng pháp đẳng dịng.
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thành phần pha động đến diện tích pic và thời gian lƣu đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic
Thành phần pha động % K2HPO4 95 90 85 80 75 70 90 80 70 ACN 5 10 15 20 25 30 0 0 0 MeOH 0 0 0 0 0 0 10 20 30
Thời Gian Lƣu (phút) Saccharin 9,40 5,04 3,31 2,77 2,68 2,90 9,06 4,60 3,16 Aspartam 77,1 21,7 8,36 4,41 3,02 3,86 97,6 31,5 13,4 A. Benzoic 30,7 15,9 9,38 6,40 4,83 5,04 32,4 16,9 9,65 A. Sorbic 54,5 25,7 14,2 8,98 6,30 6,28 60,7 28,3 14,6 Kết quả thực nghiệm cho thấy: Chế độ chạy sắc ký pha động thành phần không đổi (isocratic) với các tỷ lệ khác nhau của thành phần pha động thì khi giảm tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, thời gian lƣu giữ của một số chất phân tích trên cột giảm, chúng ra sớm nên rất dễ lẫn với tạp chất khi phân tích mẫu thực tế. Khi tăng tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, các chất phân tích ra muộn, đặc biệt là aspartam bị doãng pic. Nhƣ vậy sẽ làm giảm độ nhạy của phƣơng pháp phân tích. Sắc đồ hỗn hợp các chất phân tích với thành phần pha động KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v) tại bƣớc sóng 210nm, 226nm và 254nm đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích, thành phần pha động KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm.
Qua kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy: việc tách và định lƣợng các chất theo chế độ đẳng dịng là khơng phù hợp với thực tế u cầu phân tích (trong cùng một tỷ lệ dung mơi, có chất thời gian lƣu q ngắn, có chất thời gian lƣu quá dài). Do đó chúng tơi chuyển sang chế độ gradient pha động. Bên cạnh đó, chúng tơi chọn hệ dung mơi là KH2PO4 : ACN vì khoảng cách thời gian lƣu của các chất khi chạy với hệ dung môi này khá đều, thuận tiện cho chế độ chạy gradient.
3.1.1.4. Khảo sát pH của pha động
Nếu pH của pha động cao, aspartam sẽ bị phân hủy. pH của pha động chỉ nên trong khoảng 2-7, vì lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của các hạt silic trên pha tĩnh. pH tốt nhất để tách các chất phân tích này là vùng acid vì ở vùng pH này, các chất phân tích tồn tại ở dạng acid nên hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn. Sau khi tham khảo tài liệu [18], chúng tôi sử dụng pha động là dung dịch đệm KH2PO4 0,02M (pH = 4,3) và ACN. Điều chỉnh để đƣợc dung dịch KH2PO4 pH = 3 và pH = 5 bởi dung dịch acid H3PO4 đặc và dụng dịch KOH trên máy đo pH. Tiến hành khảo sát các điểm pH khác nhau của dung dịch KH2PO4 (pH = 3, pH = 4,3, pH = 5), tỷ lệ dung môi pha động là KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v). Tốc dộ dịng là 1 ml/phút, thể tích bơm mẫu 20 µl, chất chuẩn hỗn hợp có nồng độ 5 ppm. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của pH pha động đến thời gian lƣu của các chất phân tích đƣợc thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH pha động đến thời gian lưu của chất phân tích
pH Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic (mAU) Sac Asp BA SA Sac Asp BA SA 3 3,120 4,843 14,617 14,092 615,68 165,79 441,25 845,84 4,3 2,759 4,464 6,174 8,822 661,46 167,06 416,38 891,96 5 2,786 4,276 3 3,297 970,9 171,2 - 925,53 Saccharin và aspartam là hai chất có độ phân cực cao nhất trong các chất đang nghiên cứu, nên 2 chất này thƣờng có thời gian lƣu ngắn nhất (đặc biệt là saccharin), cịn 2 chất bảo quản có thời gian lƣu dài hơn vì có độ phân cực thấp hơn. Dung dịch đệm có pH = 3, pH này nhỏ hơn so với pKa của các chất nghiên cứu (bảng 1.1) nên tất cả các chất nghiên cứu đều tồn tại dạng phân tử aid, vì vậy các chất bị lƣu giữ lâu nhất. Với điều kiện pH = 4,3, saccharin và acid benzoic đã bắt đầu chuyển sang dạng ion nên thời gian lƣu ngắn đi hẳn. Hai chất còn lại vẫn tồn tại dạng acid nên thời gian lƣu có giảm nhƣng ít hơn. Với pH = 5, thời gian lƣu của cả 4 chất đều giảm rất lớn. Tuy vậy, trong điều kiện pH = 4,3 thời gian lƣu của các chất cách đều nhau hơn, thuận tiện cho việc khảo sát phƣơng pháp bằng chế độ gradient. Mặt khác, đa số diện tích pic của các chất ở pH này cao hơn, pic nhọn và cân đối hơn so với pic ở pH = 3. Nên chúng tôi chọn pH của dung dịch đệm là 4,3 để thực hiện nghiên cứu.
Để giảm thiểu đƣợc chi phí phân tích các chất trên trong thực phẩm, thời gian lƣu của 1 chất khơng đƣợc q dài, nếu thời gian lƣu dài, ngồi việc tăng chi phí, các pic sẽ kém nhọn và kém cân đối, làm giảm sự chính xác của phép đo. Nhƣng nếu pic ra sớm quá sẽ lẫn tạp chất có trong nền mẫu hoặc pic dung mơi. Nói chung, phù hợp nhất là thời gian lƣu từ 6 – 10 phút.
Vì chƣơng trình chạy đẳng dịng khơng đáp ứng đƣợc u cầu trên nên chúng tôi tiến hành khảo sát chƣơng trình rửa giải gradient. Cố định các điều kiện sắc ký:
- Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm)
- Pha động: Kênh A (ACN), kênh D (KH2PO4 0,02M,pH=4,3) - Detector DAD với bƣớc sóng 210 nm, 226 nm, 254 nm
- Mẫu phân tích là hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khoảng 10 ppm - Tốc độ dịng vẫn giữ 1 ml/phút
Các kết quả nhƣ sau:
Chế độ gradient 1: Tỷ lệ dung môi là 95% dung dịch đệm pH= 4,3: 5% ACN (theo
thể tích) đƣợc duy trì từ lúc chạy nền đến khi bơm mẫu đƣợc 1 phút, sau đó tỷ lệ đó đƣợc thay đổi dần đến phút thứ 3 thì đạt 80% đệm : 20% ACN. Duy trì tỷ lệ này đến khi kết thúc phân tích 1 mẫu. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 1 đƣợc biểu diễn ở hình 3.6.
Bảng 3.3 cho thấy: với tỷ lệ 95% dung dịch đệm:5% ACN (theo thể tích) thì các chất phân tích ra rất muộn, trong khi đó, ở tỷ lệ 80% dung dịch đệm:20% ACN (theo thể tích) các chất lại ra rất sớm. Kết hợp 2 tỷ lệ trên trong một chƣơng trình gradient, thời gian lƣu của các chất ra sớm đã đƣợc lùi lại, sau đó lại nhanh chóng kéo các chất cịn lại ra nhanh hơn. Mặc dù thời gian lƣu của chất ra đầu tiên đã là hơn 6 phút nhƣng thời gian lƣu của chất ra cuối cùng vẫn dài hơn 10 phút. Vì vậy chúng tơi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi lên từ sau phút thứ 6. Tốc độ dòng vẫn giữ 1 ml/phút trong chế độ gradient 2.
Chế độ gradient 2
Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 đƣợc thể hiện ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2
t (phút) 0 1 3 6
% đệm 95 95 80 55
Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2 đƣợc biểu diễn ở hình 3.7.
Hình 3.7. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2
Mặc dù pic ra cuối cùng vào khoảng 8,70 phút nhƣng các pic quá gần nhau, có thể khó khăn khi tách chất ở nền mẫu thự tế. Để cải thiện vấn đề trên, chúng tôi đã giảm tốc độ dịng tại thời điểm tỷ lệ dung mơi cao nhất so với dung dịch đệm.
Chế độ gradient 3
Tỷ lệ dung mơi và tốc độ dịng của chế độ gradient 3 đƣợc thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Tỷ lệ dung mơi và tốc độ dịng của chế độ gradient 3
t (phút) 0 1 3 6 7,5
% đệm 95 95 80 55 55
Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 0,8 1 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 3 đƣợc biểu diễn ở hình 3.8.
Hình 3.8. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 3
Các pic đã giãn ra đôi chút so với chƣơng trình gradient 2 nhƣng vẫn cần điều chỉnh giảm tỷ lệ dung mơi và tốc độ dịng để pic giãn phù hợp hơn, đồng thời giúp cho pic của aspartam cân đối.
Gradient 4
Tỷ lệ dung mơi và tốc độ dịng của chế độ gradient 4 đƣợc thể hiện ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Tỷ lệ dung mơi và tốc độ dịng của chế độ gradient 4
t (phút) 0 1 3 6 7,5 9 9,5 10 % đệm 95 95 80 55 55 55 95 95 Tốc độ dòng (ml/phút) 1,0 1,0 1,0 0,8 0,6 0,8 1,0 1,0
Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 4 đƣợc biểu diễn ở hình 3.9.
Hình 3.9. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 4
Chất phân tích trong sắc đồ thu đƣợc có thời gian lƣu hợp lý hơn (bảng 3.8): saccharin: 6,519; aspartam: 8,231; acid benzoic: 9,393; acid sorbic: 9,866 (phút).
Diện tích pic và thời gian lƣu của các chất trong 4 chƣơng trình gradient vừa khảo sát đƣợc so sánh trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Thời gian lưu và diện tích pic theo các chương trình gradient Chế độ gradient 1 Chế độ gradient 2 Chế độ gradient 3 Chế độ gradient 4 Thời gian lưu (phút) Sac 6,149 6,147 6,526 6,519 Asp 7,906 7,268 7,719 8,231 BA 9,615 8,203 8,626 9,393 SA 12,096 8,700 9,080 9,866 Diện tích píc (mAU) Sac 1273,85 1267,09 1481 1726,06 Asp 429,191 451,404 405,442 626,816 BA 850,642 893,268 896,601 977,314 SA 793,79 829,201 977,314 826,708
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, diện tích pic đƣợc chạy bằng chƣơng trình gradient 4 là lớn nhất, pic cũng cân đối hơn. Vì vậy chúng tơi chọn chƣơng trình gradient 4 cho việc rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột và giữ cố định điều kiện này cho các bƣớc tiếp theo.
Nhƣ vậy, nghiên cƣ́u có các thông số để cha ̣y HPLC nhƣ sau:
- Cột tách: RP18 - C18 (250mm × 4,6mm × 5μm) - Hãng Agilent. - Nhiệt độ cột: 30OC
- Thể tích bơm mẫu: 20l
- Detecter: DAD ở bƣớc sóng 210 nm, 226 nm, 254 nm
Thành phần pha động: Kênh A: ACN; kênh D: KH2PO4 (pH = 4,3)
- Tỷ lệ dung mơi và tốc độ dịng: tn theo chƣơng trình gradient ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Chương trình gradient pha động và tốc độ dịng tối ưu
Thời gian (phút) % ACN % KH2PO4 pH = 4,3 Tốc độ dòng ml/phút 0 5 95 1,0 1 5 95 1,0 3 80 20 1,0 6 45 55 0,8 7,5 45 55 0,6 9 45 55 0,8 9,5 5 95 1,0 10 5 95 1,0
3.1.2. Tối ưu quá trình xử lý mẫu
Trong quá trình chế biến thực phẩm, khi các chất phụ gia thêm vào sẽ liên kết, hòa trộn trong thực phẩm. Để xác định đƣợc các chất đó, chúng ta phải tách đƣợc các chất phụ gia ra khỏi nền mẫu. Chúng tơi chọn mẫu phân tích là mẫu thạch
bách vị để khảo sát xử lý mẫu phân tích hàm lƣợng saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic vì trong mẫu này chứa cả 4 chất cần phân tích trên.
Sơ đồ 3.1: Qui trình phân tích mẫu dự kiến
Các chất bảo quản hoặc chất tạo ngọt, khi thêm vào mẫu hầu nhƣ ở dạng muối của chúng, vì vậy ta có thể chiết chúng ra khỏi nền mẫu bằng nƣớc. Tuy nhiên, cung có thực phẩm có mặt cả dạng acid và dạng muối của phụ gia đó. Dạng acid ít tan trong nƣớc nhƣng tan nhiều trong MeOH. Vì vậy, khi xử lý chúng tơi thêm MeOH vào mẫu trƣớc khi chiết với nƣớc.
Trong quy trình xử lý mẫu này, thời gian rung siêu âm và lƣợng MeOH thêm vào là yếu tố có khả năng ảnh hƣởng nhiều nhất đến kết quả. Vì vậy chúng tơi tiến hành khảo sát hai yếu tố này.
2ml Dung dịch Carrez 1 Lắc vortex Mẫu cân khoảng (2-10g) hoặc (5-20ml)
2ml Dung dịch Carrez 2 Lắc vortex vortex HPLC 30ml H2O Định mức bằng nƣớc Lọc qua giấy lọc Đồng nhất mẫu
Rung siêu âm
Ly tâm
MeOH Lắc vortex Rung siêu âm
3.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Cân 4 mẫu thạch bách vị với khối lƣợng tƣơng đồng nhau, thực hiện quy trình xử lý mẫu tƣơng tự nhau trừ thời gian siêu âm. Mẫu 1: chỉ lắc với nước, mẫu
2: lắc đều rồi siêu âm 15 phút, mẫu 3: lắc đều rồi siêu âm 30 phút, mẫu 4: lắc đều và rung siêu âm 60 phút. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm
Mẫu 1: không siêu âm Mẫu 2: Siêu âm 15 phút Mẫu 3: Siêu âm 30 phút Mẫu 4: Siêu âm 60 phút Khối lƣợng mẫu (g) 3,2453 3,2438 3,3016 3,0123 Diện tích pic Sac (SSac) 879,121 905,184 950,522 864,89
SSac/ Khối lƣợng mẫu 270,9 279,1 287,9 287,1
Diện tích pic Asp 75,618 139,844 152,367 149,223
SAap/ Khối lƣợng mẫu 23,30 43,11 46,15 49,54
Diện tích pic BA 7041,83 7177,93 7574,34 6943,76
SBA/ Khối lƣợng mẫu 2169,9 2212,8 2294,1 2305,1
Diện tích pic SA 2025,86 1976,67 2090,4 1923,26
SSA/ Khối lƣợng mẫu 624,2 609,4 633,1 638,5
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, diện tích pic/khối lƣợng mẫu tăng dần khi