3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện chạy sắc ký 3.1.1. Van bơm mẫu 3.1.1. Van bơm mẫu
Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lí cơ bản là mẫu ban đầu đƣợc nạp vào trong vịng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xilanh ở áp suất thƣờng, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp vào trong cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lƣợng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột. Dựa vào khả năng thay đổi các vịng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi đựơc lƣợng mẫu bơm vào vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần mở rộng chân pic sắc ký –làm cho pic dỗng. Nếu nhƣ vịng mẫu q dài, lựơng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng pic xảy ra càng lớn, gây ra sự chen lấn pic trong q trình tách. Nếu thể tích bơm mẫu là q nhỏ thì sai số cũng rất lớn
Lƣợng mẫu đƣợc xác định bằng thể tích vịng chứa mẫu mà ta chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích pic sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu>Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng khơng tăng đƣợc nữa, pic sẽ dỗng, tù và khơng sắc nét nữa. Vì vậy việc lựa chọn thể tích vịng mẫu cũng rất quan trọng [3,6,7].
Hiện nay, van bơm mẫu sáu chiều rất phổ biến, do đó chúng tơi lựa chọn loại van này và thể tích vịng bơm mẫu là 20l.
3.1.2. Cột tách
Với sắc ký HPLC thì cột tách hay pha tĩnh có vai trị rất quan trọng, nó quyết định hiệu quả tách của q trình. Bản chất pha tĩnh quyết định đến cơ chế tách và khả năng lƣu giữ của chất tan. Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích mà chọn
pha tĩnh cho phù hợp. Kích thƣớc hạt nhồi, chiều dài cột phải phù hợp với quá trình tách và xác định chất [7].
Vì vậy, chúng tơi lựa chọn cột pha đảo RP-HPLC để phân tích, trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi đã sử dụng cột tách C18 inertsil ODS-3 (250mm × 2,1mm ì 5àm) phõn tớch, tách và định lƣợng các glycoside. Nhiệt độ cột 300
C.
3.1.3. Detector
Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp, thơng thƣờng để theo dõi chất phân tích có hai cách: loại theo dõi tính chất của pha động và loại theo dõi tính chất của chất phân tích từ trong pha động chảy ra một cách liên tục. Trên thực tế cũng cần lƣu ý là sự theo dõi khơng hồn tồn là tính chất pha động hay chất tan mà là cả hai, với mức độ khác nhau. Các loại detector thơng dụng là UV-VIS, huỳnh quang, điện hố và độ dẫn. Trên thực tế, hầu hết các chất phân tích đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV-VIS, do đó detector UV-VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu và hầu hết các thiết bị sắc kí lỏng đƣợc trang bị loại detector này. Một kỹ thuật mới phát triển gần đây trong detector UV-VIS sử dụng diode array, chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS[3,6,7]. Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phịng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PDA để phát hiện và phân tích chất phân tích.
3.1.4. Bước sóng hấp thụ cực đại của các glycoside tim
Hai chất glycoside tim đƣợc nghiên cứu trong bản luận văn này là digoxin và digitoxin. Cả hai chất này có bƣớc hấp thụ quang cực đại giống nhau là đều ở 220nm. Dải phổ hấp thụ của các glycoside tim này đƣợc quét trên detector PDA từ 190 nm đến 370 nm. Hình 3.1 là phổ UV của 02 glycoside: