1.3 .Các phƣơng pháp phân tích kháng sinh tetracycline
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu
Mẫu phân tích đƣợc lấy về phịng thí nghiệm sau khi mã hóa, đƣợc chia thành 2 phần, một phần lƣu giữ trong tủ lạnh âm sâu (-200C) một phần để phân tích.
Tiền xử lý mẫu: Đối với các mẫu thủy sản nhƣ tơm, cá, mực, hàu sữa… bóc hết vỏ, mai, ruột, vẩy, xƣơng chỉ lấy phần thịt ăn đƣợc, đối với mâu thịt chỉ lấy phần thịt nạc bỏ hết mỡ và bì. Sau đó đồng nhất tồn bộ lƣợng thịt thu đƣợc bằng máy đồng nhất mẫu và phân tích ngay, nếu khơng phải đƣợc bảo quản trong bể lạnh (-200C).
-Chuẩn bị mẫu:
+Chuẩn bị mẫu phân tích: mẫu sau khi đƣợc đồng nhất cân những lƣợng bằng nhau (5 gam ) vào ống fancol 50 mL, thƣờng mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần và kèm một mẫu thêm chuẩn.
+ Chuẩn bị mẫu trắng: là mẫu giống nhƣ mẫu phân tích nhƣng khơng có thành phần tetracycline.
Mẫu trắng thịt: lựa chọn thịt của công ty Lebio.
Mẫu trắng thủy sản: lựa chọn các sản phẩm thủy sản trong siêu thị Vinmex.Các mẫu trắng gửi song song tại 2 phịng thí nghiệm đã đạt ISO 17025 về chỉ tiêu phân tích nhóm tetracycline là trung tâm phân tích nơng sản vùng 1 và viện kiểm nghiệm quốc gia đều cho kết quả là không phát hiện. Mẫu trắng đƣợc xử lý giống nhƣ mẫu phân tích.
- Mẫu trắng thêm chuẩn: Cân trên cân phân tích vào 7 ống fancol một lƣợng (5 gam ) mẫu trắng vào mỗi ống, sau đó thêm 2 mL từng dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ (5,10,20,40,60,80,100 µg/L) vào lần lƣợt từng ống để xây dựng đƣờng chuẩn làm việc, sau đó lắc bằng máy lắc trịn 1 phút để chuẩn phân bố đều vào trong mẫu, sau đó để yên trong 30 phút để chuẩn có thời gian thẩm thấu vào trong mẫu.
- Mẫu thêm chuẩn: Bổ sung 2 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ 20 µg/L vào mẫu phân tích.Tiến hành nhƣ chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn.
-Xử lý mẫu:
+Chiết mẫu: Cân chính xác khoảng 5 g 0,100g mẫu đã đồng nhất ở trên vào ống
fancol 50 mL, thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA, lắc xoáy trong 1 phút. Lắc 10 phút trên máy lắc ngang sau đó siêu âm trong vịng 10 phút. Ly tâm lạnh (-150C) ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào ống ly tâm thứ 2, phần bã đƣợc chiết tiếp với 10 ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA, lắc xoáy 1 phút, đem ly tâm lạnh ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Gộp dịch chiết vào ống fancol 50 mL thứ 2, thêm 1 ml acid trichloracetic 1.0 g/ml, lắc khoảng 30 giây.Ly tâm lạnh ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút.Lọc dịch chiết qua giấy lọc vào bình nón 100 ml. Dịch lọc đƣợc làm sạch qua cột SPE-C18.
Làm sạch và làm giầu mẫu:Trƣớc tiên cần hoạt hoá cột lần lƣợt bằng 3 ml MeOH loại tinh khiết phân tích, 3 ml nƣớc cất deion, 3mL đệm Mc llvaine EDTA, sau đó nạp mẫu qua cột, tốc độ chảy khơng quá 2 ml/phút. Khi toàn bộ lƣợng mẫu đã đƣợc nạp xong, loại bỏ tạp chất bằng 3 ml nƣớc cất.Hút khô 1 phút bằng máy hút chân khơng, sau đó ly tâm tách nƣớc ở tốc độ 5000 vịng/phút trong 5 phút. Cuối cùng rửa giải bằng 2 ml dung môi MeOH loại đặc biệt tinh khiết dùng cho MS/MS, tốc độ rửa giải không quá 2mL/phút, lọc qua màng 0,45 µm rồi bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.