Tiến hành phân tích mẫu trắng (mẫu thịt) thêm chuẩn ở nồng độ20 µg/kg, tiến hành phân tích lặp 6 mẫu song song, các yếu tố cần tối ƣu bao gồm: thành phần hoạt hóa cột và tốc độ nạp mẫu, tốc độ rửa giải. Tính tốn hệ số thu hồi. Kết quả đƣa ra trong bảng 3.6.
-Tốc độ nạp mẫu và tốc độ rửa giải: lựa chọn tốc độ chảy tự nhiên khoảng 3mL/phút , giảm 2 mL/phút, 1 mL/phút.
-Thành phần rửa giải : Methanol – EDTA và Methanol - Thể tích rửa giải: 2 mL
Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi khi thay đổi các điều kiện chiết pha rắn SPE
Các điều kiện Hiệu suất thu hồi R (%)
TC OTC CTC
Tốc độ nạp mẫu và tốc độ rửa giải 3mL/phút
70,4 74,3 68,2
Tốc độ nạp mẫu và tốc độ rửa giải 2mL/phút
86,5 88,7 84,3
Tốc độ nạp mẫu và tốc độ rửa giải 1mL/phút
88,2 90,4 85,7
Rửa giải bằng Methanol 87,2 89,9 86,5
Nhận thấy, tốc độ nạp mẫu và rửa giải càng nhỏ càng tốt, tuy nhiên mất nhiều thời gian phân tích và hệ số thu hồi giữa 1 mL/phút và 2 mL/phút chênh lệch không đáng kể, do vậy lựa chọn tốc độ nạp mẫu và rửa giải <2 mL/phút. Rửa giải bằng dung môi methanol cho hiệu suất cao hơn methanol- EDTA, theo lý thuyết quá trình rửa giải bằng methanol _EDAT tốt hơn do loại bỏ tiếp các liên kết của chất phân tích với tạp chất, tuy nhiên khi có muối EDTA khơng thuận lợi cho q trình sắc kí. Do vậy lựa chọn dung môi methanol làm dung môi rửa giải.
Sau khi đã tối ƣu hóa các điều kiện phân tích, qui trình phân tích chuẩn đƣợc xây dựng nhƣ trong lƣu đồ (qui trình phân tích)
Qui trình phân tích
3.3. Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
3.3.1. Giới hạn phát hiện của thiết bị
Khảo sát nồng độ chuẩn 1-0,6-0,4 µg/L cho từng đơn chất,tính tỉ lệ tín hiệu phân tích/nhiễu (signal/noise S/N) cho kết quả trong bảng 3.7
Bảng 3.7Tỷ số S/N đối với từng chất (TC,OTC,CTC) ở từng nồng độ chuẩn (lặp lại 10 lần) Nồng độ 1 µg/L Tên chất Tỉ lệ S/N TC 8,77 7,67 6,87 9,12 10,23 7,89 8,67 8,98 10,62 7,99 OTC 8,99 9,98 9,91 8,97 7,89 10,87 8,89 9,92 9,13 8,26 CTC 6,78 8,87 9,67 7,89 6,98 7,98 8,88 9,68 7,88 6,98 Nồng độ 0.6 µg/L TC 6,34 6,78 5,33 5,32 7,86 6,55 4,32 6,45 7,32 6,34 OTC 5,44 6,34 6,32 5,89 6,23 7,34 7,35 7,32 6,45 6,12 CTC 4,55 6,32 7,34 5,43 6,15 7,19 6,49 6,58 5,93 5,82 Nồng độ 0.4 µg/L TC 3,89 3,12 2,99 2,78 3,45 3,98 4,02 3,78 3,45 3,98 OTC 4,21 3,91 3,82 3,76 3,19 3,18 3,27 3,78 3,97 3,65 CTC 3,02 3,05 3,09 3,77 3,45 4,19 4,22 3,07 2,78 3,01
Qua kết quả khảo sát chuẩn lặp lại của 10 lần, nhận thấy, tại nồng độ 1 µg/L S/N vẫn còn khá cao đối với cả 3 chất, dựa vào tỉ lệ đó giảm xuống 0,6 µg/L nhận thấy S/N giảm rõ rệt, tuy nhiên chƣa có kết quả nào chạm ngƣỡng 3. Dựa vào tỉ lệ S/N của 2 chuẩn trên chọn tiếp khảo sát ở nồng độ 0,4 µg/L. Nhận thấy với TC,OTC và CTC có kết q S/N >3,. Với kết quả nhƣ vậy, chọn IDL=0,4 µg/L với cả 3 chất phân tích
3.3.2. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL)
Từ kết quả IDL =0,4µg/kg, thêm chuẩn vào mẫu trắng có nồng độ 0,4-0,8-1,6 µg/kg, sau đó tiến hành chiết mẫu theo đúng qui trình, khảo sát tỉ lệ tín hiệu phân tích trên tín hiệu nhiễu nền S/N đƣợc thể hiện qua 3.8
Bảng 3.8 Kết quả tính S/N đối với từng chất (TC,OTC,CTC) ở từng nồng độ mẫu thêm chuẩn Nồng độ 0,4 µg/kg Tên chất Tỉ lệ S/N TC KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH OTC KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH CTC KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH Nồng độ 0,8 µg/kg TC 2,03 KPH 1,87 1,99 KPH 2,02 1,76 KPH KPH 2,03 OTC KPH 1,87 KPH 1,77 2,01 KPH 2,34 KPH 1,09 1,88 CTC KPH 2,09 2,45 KPH 2,99 1,98 2,06 3,02 KPH KPH Nồng độ 1,6 µg/kg
TC 3,45 3,78 3,33 4,23 3,67 3,54 3,87 3,90 4,06 4,56
OTC 3,91 3,82 3,73 3,65 3,99 4,67 4,89 3,89 3,90 4,02
CTC 3,98 3,45 3,76 3,90 3,86 3,57 3,86 3,95 3,57 4,05
Nhận thấy, qua kết quả bảng 3.8 ở các nồng độ thêm chuẩn 0,4 µg/kg khơng phát hiện đƣợc chất phân tích, ở nồng độ 0,8 µg/kg có phát hiện đƣợc, tuy nhiên kết quả phân tích cho tỉ lệ S/N nhỏ hơn 3 và. Ở nồng độ 1,6 µg/kg hồn tồn cho kết quả 100% mẫu phân tích có S/N ≥3. Do vậy lựa chọn MDL của phƣơng pháp đối với cả 3 chất tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline = 1.6 µg/kg
3.3.3. Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (MQL)
Từ kết quả MDL đã có, tính MQL = MDL x3 = 1,6x3=4,8 µg/kg. Để thuận tiện cho phân tích và pha chuẩn chọn giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp MQL = 5,0 µg/kg. Kiểm tra tính phù hợp của MQL thơng qua độ lặp lại và thu hồi ở 10 mẫu lặp thêm chuẩn hỗn hợp ở nồng độ 5,0 µg/kg đối với mỗi chất, kết quả thể hiện qua bảng 3.9
Bảng 3.9 : Độ lặp lại, thu hồi của phƣơng pháp tại nồng độ MQL =5,0 µg/kg đối với từng chất (TC,OTC,CTC) Chất phân tích Kết quả phân tích TB RTB % % RSD L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 TC 4,534 4,826 4,433 4,639 4,712 4,716 4,322 4,223 5,044 5,165 4,661 93,228 6,431 OTC 4,771 4,615 4,674 4,871 4,572 4,761 4,962 4,641 5,197 4,577 4,764 95,282 4,171
CTC 4,623 4,582 5,553 4,953 5,054 5,141 4,579 4,837 4,796 5,137 4,926 98,510 6,262
Theo yêu cầu của phụ lục F – tiêu chuẩn AOAC (2012) qui định, ở nồng độ 5,0µg/kg <10,0 µg/kg , cho phép RSD % <21 % và hệ số thu hồi 65-110 %. Qua
bảng kết quả nhận thấy, %RSD đối của 3 chất nhỏ nhất là OTC - 4,171% và lớn nhất là TC -6,431 % phù hợp với qui định. Hệ số thu hồi đối với TC trong khoảng 84,46 – 103,94%, đối với OTC trong khoảng 91,54 – 103,94%, đối với CTC trong khoảng 91,58 – 11,06% hoàn toàn nằm trong giới hạn qui định cho phép. Do vậy giá trị MQL = 5,0 µg/kg là kết quả tin cậy và phù hợp.
3.3.4. Phƣơng trình hồi qui tuyến tính
Xây dựng đƣờng chuẩn hồi qui tuyến tính dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và mảnh ion con có cƣờng độ lớn hơn.Bảng 3.10 cho biết mối tƣơng quan giữa nồng độ chất phân tích và diện tích peak của 2 mảnh con đặc trƣng cho mỗi chất (TC,OTC và CTC)
Bảng 3.10 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ TC,OTC và CTC
TT Diện tích pic Nồng độ (µg/kg) 5,0 10 20 40 60 80 100 200 1-1 Tetracycline (m/z= 410) 3176 6455 12354 24609 36978 48353 118533 236781 1-2 Tetracycline (m/z= 427) 749 2164 3597 9164 13675 17165 42922 85123 2-1 Oxytetracycline (m/z= 426) 2737 5602 13112 25422 36789 46790 117949 224567 2-2 Oxytetracycline 1223 2085 3728 9376 13887 17442 38445 80456
(m/z= 443) 3-1 Chlotetracycline (m/z= 444) 752 2035 3800 7053 11089 15087 37551 76456 3-2 Chlotetracycline (m/z= 462) 611 1362 2691 5155 7234 9260 23554 47023
Khi xây dựng đƣờng chuẩn để phân tích, lựa chọn mảnh ion con có cƣờng độ lớn hơn làm mảnh định lƣợng, mảnh còn lại làm mảnh định danh. Theo số liệu Bảng 3.10 mảnh ion định lƣợng cho tetracycline là mảnh m/z = 410 Oxytetracycline chọn mảnh m/z = 426, Chlotetracycline chọn mảnh m/z = 444.
Hình 3.7. Đƣờng chuẩn xác định tetracycline
Hệ số tƣơng quan hồi qui tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 5-200 µg/kg là R=0,9992975 cho thấy có sự tƣơng quan tuyến tính rõ rệt
Phƣơng trình hồi qui tuyến tính: y=601,017x + 168,845 Kiểm tra độ chệch của các điểm chuẩn cho kết quả bảng 3.11
Nồng độ thực 5 10 20 40 60 80 100 200
Kết quả đo 5,01 10,02 19,69 39,72 59,67 79,98 98,78 196,94
Độ chệch (%) 0,2 0,2 1,55 0,7 0,6 0,1 1,2 1,6
Theo tiêu chuẩn EC/657/2002 độ chệch cho phép <15% , nhƣ vậy các điểm chuẩn có độ chệch trong khoảng từ 0,2 – 1,6% <15% cho thấy đƣờng chuẩn có độ tin cậy đáp ứng yêu cầu của các tiêu chuẩn
Hình 3.8 Đƣờng chuẩn xác định oxytetracycline
Hệ số tƣơng quan hồi qui tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 5-200 µg/kg là R=0,9993926 cho thấy có sự tƣơng quan tuyến tính rõ rệt
Phƣơng trình hồi qui tuyến tính: y=593,634x+ 282,767 Kiểm tra độ chệch của các điểm chuẩn cho kết quả bảng 3.12
Nồng độ thực 5 10 20 40 60 80 100 200
Kết quả đo 5 9,94 20,29 39,71 57,45 78,98 95,78 198,21
Độ chệch (%) 0 0,6 1,5 0,7 4,3 1,3 4,2 0,9
Theo tiêu chuẩn EC/657/2002 độ chệch cho phép <15% , nhƣ vậy các điểm chuẩn có độ chệch trong khoảng từ 0,0 – 4,3% <15% cho thấy đƣờng chuẩn có độ tin cậy đáp ứng yêu cầu của các tiêu chuẩn
Hình 3.9 Đƣờng chuẩn xác định CTC
Hệ số tƣơng quan hồi qui tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 5-200 µg/kg là R=0,99998039 cho thấy có sự tƣơng quan tuyến tính rõ rệt
Phƣơng trình hồi qui tuyến tính: y=188,648 x+ 114,048 Kiểm tra độ chệch của các điểm chuẩn cho kết quả bảng 3.13
Nồng độ thực 5 10 20 40 60 80 100 200
Kết quả đo 5,09 10,87 20,30 41,20 57,55 78,99 102,56 196,21
Độ chệch (%) 1,8 8,7 1,5 3,0 4,1 1,3 2,6 1,9
Theo tiêu chuẩn EC/657/2002 độ chệch cho phép <15% , nhƣ vậy các điểm chuẩn có độ chệch trong khoảng từ 1,3 – 8,7% <15% cho thấy đƣờng chuẩn có độ tin cậy đáp ứng yêu cầu của các tiêu chuẩn.
Nhƣ vậy khảo sát khoảng tuyến tính 5-200 µg/kg, cho kết quả tƣơng quan tuyến tính rõ rệt, độ chệch đáp ứng các yêu cầu của tiêu chuẩn, do vậy chọn khoảng làm việc trong khoảng từ 5-200 µg/kg trùng với khoảng tuyến tính đã khảo sát.
3.3.5. Độ chính xác của phƣơng pháp
Phân tích 12 mẫu thêm chuẩn lặp lại ở 2 nồng độ 20 ppb và 50 ppb, phân tích trong điều kiện lặp lại (phân tích trong một khoảng thời gian ngắn, trên cùng một thiết bị phân tích của một phƣơng pháp phân tích và do một ngƣời làm). Đánh giá độ lặp lại thơng qua tính tốn hệ số biến thiên CV%, độ đúng thông qua hệ số thu hồi và so sánh với bảng giá trị yêu cầu theo phụ lục F của AOAC. Bảng 3.14 và 3.15 là kết quả phân tích lặp lại của 3 chất tetracycline, oxytetracycline và chlotetracycline.
Bảng 3.14 Độ lặp lại, thu hồi của phƣơng pháp tại nồng độ 20 µg/kg, n=12 đối với từng chất (TC,OTC và CTC)
Chất phân tích Kết quả trung bình Xtb Hệ số biến thiên CV (%) Hệ số thu hồi R(%) TC 17,51 4,27 81,60 – 95,10 OTC 18,59 3,49 88,10 – 98,30 CTC 16,90 5,26 81,40 – 91,00
Theo phụ lục F của AOAC 2016, tại nồng độ 20 µg/kg CV% phải nhỏ hơn 21 %, qua bảng 3.7 -CV% đối với 3 chất trong khoảng 3,49 – 5,26% nhỏ hơn 21 % cho thấy độ lặp lại của phƣơng pháp ở nồng độ 20 µg/kg rất tốt
Cũng theo yêu cầu yêu cầu của phụ lục này, ở nồng độ 20 µg/kg hệ số thu hồi nằm trong khoảng 60 – 115 % . Theo kết quả thu đƣợc từ bảng 3.7 nhận thấy đối với nhóm chất 3 kháng sinh nằm trong khoảng 81,40 – 98,30% nằm trong yêu cầu cho phép.
Tại nồng độ 20 µg/kg phƣơng pháp cho kết quả có độ chính xác phù hợp với các yêu cầu hiện hành.
Bảng 3.15 Độ lặp lại, thu hồi của phƣơng pháp tại nồng độ 50 µg/kg, n=12đối với từng chất (TC, OTC, CTC)
Chất phân tích Kết quả trung bình Xtb Hệ số biến thiên CV (%) Hệ số thu hồi R(%) TC 47,74 5,39 88,30 - 103,12 OTC 45,03 4,39 85,02 – 95,08 CTC 47,41 3,49 90,44 – 99,94
Theo phụ lục F của AOAC 2016, tại nồng độ 50 µg/kg CV phải nhỏ hơn21 %, qua bảng 3.8 CV% đối với 3 chất trong khoảng 3,49 – 5,39 % nhỏ hơn 21 % cho thấy độ lặp lại của phƣơng pháp ở nồng độ 50 µg/kg rất tốt. Cũng theo yêu cầu yêu cầu của phụ lục này, ở nồng độ 50 µg/kg hệ số thu hồi nằm trong khoảng 60 – 115 % . Theo kết quả thu đƣợc từ bảng 3.7 nhận thấy đối với nhóm chất 3 kháng sinh nằm trong khoảng 85,02 – 103,12 % nằm trong yêu cầu cho phép.
Tại nồng độ 50 µg/kg phƣơng pháp cho kết quả có độ chính xác phù hợp với các yêu cầu hiện hành.
Qua khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp tại 3 nồng độ 5 µg/kg, 20 µg/kg, 50 µg/kg cho thấy kết quả lặp lại, thu hồi của phƣơng pháp rất tốt. Phƣơng pháp có độ chính xác phù hợp để phân tích 3 kháng sinh TC, OTC, CTC.
3.3.6.Đánh giá kết quả phân tích mẫu so sánh liên phịng
Sử dụng mẫu chuẩn (mẫu thịt) so sánh là mẫu đƣợc gửi từ đơn vị tổ chức thử nghiệm so sánh liên phòng là viện kiểm nghiệm quốc gia (đƣợc tổ chức vào tháng 8/2017, khối lƣợng khoảng 100 gam). Phân tích lặp lại 6 lần do số lƣợng mẫu khơng có nhiều, sau đó tính kết quả trung bình phân tích của 6 lần lặp so với giá trị thực đƣợc qui cho để tính độ chệch. Bảng 3.16 thể hiện kết quả phân tích với mẫu chuẩn so sánh.
Bảng 3.16 Kết quảphân tích 3 chất TC,OTC và CTC trong mẫu chuẩn so sánh Chất Chất phân tích Kết quả phân tích (µg/kg) Kết quả trung bình (µg/kg) Nồng độ mẫu chuẩn so sánh (µg/kg) Độ chệch (%) L1 L2 L3 L4 L5 L6 TC 30,56 32,98 29,98 34,67 38,27 36,87 33,87 36,86 8,11 OTC 39,78 40,32 39,98 39,88 41,23 41,56 40,46 45,33 10,74 CTC 30,25 29,33 32,32 31,78 34,32 31,29 31,55 35,88 12,07 Theo phụ lục F của AOAC 2016, tại ngƣỡng nồng độ 35 - 46 ppb, độ chệch phải nhỏ hơn 15%. Kết quả phân tích cho thấy độ chệch nằm trong khoảng từ 8.11 – 12.07% nhỏ hơn 15% . Do vậy kết quả phân tích hồn tồn phù hợp với qui định 3.3.7. Độ đặc hiệu/chọn lọc của phƣơng pháp
Đánh giá độ dặc hiệu/chọn lọc của phƣơng pháp thông qua so sánh kết quả phân tích giữa mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp nồng độ 10 ppb. Kết quả thu đƣợc qua Hình 3.10 phổ khối của mẫu trắng và Hình 3.11 phổ khối của mẫu trắng thêm chuẩn 10 ppb
Hình 3.10 Phổ khối TC, OTC và CTC của mẫu trắng
Hình 3.11 Phổ khối CTC của mẫu trắng thêm chuẩn ở 10 ppb
So sánh phổ khối giữa mẫu trắng và mẫu trắng đã sử lý thêm chuẩn cho thấy: ở phổ đồ của mẫu trắng khơng cho tín hiệu mảnh phổ nào để xác nhận chất phân tích, trên phổ đồ của mẫu thêm chuẩn xác định rất chính xác 3 chất phân tích rõ ràng và với
đủ các mảnh phổ. Qua đó nhận thấy phƣơng pháp phân tích có độ đặc hiệu và chọn lọc tốt.
3.3.8. Độ ổn định của phƣơng pháp
Độ ổn định của phƣơng pháp phụ thuộc nhiều vào tuổi thọ của cột phân tích. Ta so sánh 2 thông số để nhận định về độ vững là áp suất bơm và diện tích peak của chuẩn phân tích ở nồng độ 100 ppb của 2 lần phân tích cách nhau 1000 lần bơm mẫu (khoảng 3 tháng sử dụng), kết quả thu đƣợc tại bảng 3.17
Bảng 3.17 Áp suất bơm và diện tích peak so sánh giữa lần bơm đầu tiên và lần bơm thứ 1000
Thông số quan sát Lần bơm mẫu đầu tiên Lần bơm mẫu sau 1000 lần
Áp suất bơm 165 psi 176psi
Diện tích peak tổng 132890 170897
Qua khảo sát nhận thấy, sau một khoảng thời gian sử dụng, cột phân tích giảm số đĩa lý thuyết và phƣơng pháp giảm độ nhạy không đáng kể.
3.3.9. Độ không đảm bảo đo
Phƣơng pháp tiếp cận để tính tốn độ khơng đảm bảo đo dựa vào kết quả validate phƣơng pháp theo hƣớng dẫn của Eurachem, AGL18 độ không đảm bảo đo bao gồm: độ chụm tổng hợp, độ đúng và độ tinh khiết của chất chuẩn
Cơng thức chung để tính độ khơng đảm bảo đo tổng hợp là: U= 2