Chọn phần mẫu vỏ phân lập các chất theo các b silica-gel cao chiết dichlometan EtOAc theo tỷ lệ tăng dầ
ADF3, ADF6.
Hình 3.1 S
ình nhưng đặc biệt có hoạt tính gây độc chọn lọ ể ện ở giá IC50 là 21,03 và 20,10 µg/ml thấp h trên dịng HepG2, Lu.
ậ ết quả cho thấy bộ phận vỏ thân loài Artocarpus nigrifol ệ ạt tính tốt với cả ba hoạt tính : kháng sinh
ệ DPPH. Do đó, chúng tơi quyết định chọn bộ ph ành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các ch ếm các chất có hoạt tính sinh học cao có khả nă
ị ệnh.
ần hóa học của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu:
ầ ẫu vỏ thân để phân lập các chất, chúng tôi tiế theo các bước đã được đưa ra trong phần thực nghi ết dichlometan với hệ dung môi rửa giải là h ỷ ệ ăng dần EtOAc (0-100%) thu được các hợp ch
Sắc ký cột cao chiết DCM và SKBM một số chiết mẫu vỏ thân
độ ọn lọc với 2 dòng tế bào ấp hơn so với giá trị
Artocarpus nigrifolius
t tính : kháng sinh, gây độc tế bào và ọn bộ phận này để nghiên ọ ủa các chất đã tách được ả năng ứng dụng trong
C.Y.Wu:
t, chúng tơi tiến hành quy trình ực nghiệm. Sắc ký cột à hỗn hợp n-hexan: ợp chất: AFD2, AFL2,
• Chất AFD2: β –
HO
Chất thu được d và EtOAc. Dựa trên các k được từ cao chiết thân AFD2
silica gel, n-hexan: EtOAc = 80:20
sitosterol chuẩn: có tín hi trưng cho H-6. Vậy, hợ
steroid tồn tại phổ biến trong th
Hình 3.2
• Chất AFL2 : friedelan
Phổ 1
H-NMR cho bi hiệu của 8 nhóm metyl bao g 1,05, 1,18 cùng với 1 tín hi 1H-NMR cịn cho thấy các tín hi –sitosterol H H H H 3 6
ợc dưới dạng kết tinh hình kim màu trắng trong h ên các kết quả sắc ký bản mỏng so sánh nhận th ết thân AFD2 với mẫu β-sitosterol chuẩn cùng có R
hexan: EtOAc = 80:20). Phổ 1H-NMR của AFD2 tr ẩn: có tín hiệu δ= 3,52 ppm đặc trưng cho H-3 và
ậy, hợp chất AFD2 được xác định là β-sitosterol,
ổ biến trong thực vật.
Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng so sánh của ADF2 và
t AFL2 : friedelan-3-one
NMR cho biết đây là một triterpen khung friedelan th
a 8 nhóm metyl bao gồm 7 tín hiệu singlet ở δH 0,73, 0,87, 0,96, 1,00, 1,01, ới 1 tín hiệu double ở δH 0,88 (3H, d; J=6,4 Hz
ấy các tín hiệu tại 2,39 (1H, ddd; J = 2,0; 5,0 & 13,8 Hz
AFD2 β
β-sitosterol
ắng trong hỗn hợp n-hexan ận thấy hợp chất tách cùng có Rf = 0,54 (TLC, a AFD2 trùng với phổ của β-
và δ= 5,35 ppm đặc sitosterol, một hợp chất
à β-sitosterol
t triterpen khung friedelan thể hiện qua tín ,73, 0,87, 0,96, 1,00, 1,01, 6,4 Hz; H-23). Trên phổ 2,0; 5,0 & 13,8 Hz) được
gán cho 2H-a và 2,30 (1H, dd; J=7,2 & 13,0Hz) được gán cho 2H-b ; 2,24 (1H, q;
J=6,5 Hz) cho H4.
Phổ 13C-NMR được nêu trong bảng 3.4 cho thấy phân tử AFL2 có 30 nguyên tử carbon bao gồm 7 carbon bậc 4 trong đó có tín hiệu của một nhóm carbonyl ở δC = 213,1ppm ; 4 tín hiệu CH, 11 tín hiệu CH2 và 8 tín hiệu CH3. Ngồi tín hiệu ở 213,1 ppm, tất cả các tín hiệu của các carbon cịn lại đều ở trong vùng từ 6,82 – 59,54 ppm cho thấy trong phân tử chỉ có một nhóm chức carbonyl.
Các số liệu phổ thu được hoàn toàn đồng nhất với số liệu phổ của friedelan- 3-one trong tài liệu [22]. Do đó, cấu trúc của hợp chất được xác định là friedelan- 3-one (friedelin). Trong một nghiên cứu gần đây, thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho thấy friedelan-3-one có hoạt tính gây độc với dịng tế bào lympho T (T- lymphoblastic leukemia, CEMSS) ở giá trị LD50 là 5,8 µg/ml [25]. Ngồi ra, các nghiên cứu khác cũng cho thấy chất này có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt trên chuột thực nghiệm [25].
• Chất AFD3: axit betulinic
Đây là chất kết tinh ở dạng tinh thể hình kim khơng màu trong MeOH, không hấp thụ tia tử ngoại, điểm nóng chảy 276-280oC.
Phổ 1H- NMR cho các thấy sự hiện diện của hai proton nhóm exometylen [ δH 4,61 (1H, br s, H-29) và 4,74 (1H, br s, H=29)], một tín hiệu OH [ δH = 3,19
(1H, dd, J =11,3 và 4,8 Hz, H-3)], một proton allyl [ δH 3,00 (1H, dt, J =11,0 và
4,8 Hz,H-19)], một nhóm metyl vinyl [ δH 1,69 (3H, s, H3-30)], và 5 nhóm metyl bậc ba [ δH 0,76 (3H, s, H3-24), 0,83 (3H, s, H3-25), 0,94 (3H, s, H3-23), 0,97 (3H, s, H3-26) và 0,98 (3H, s, H3-27)].
Phổ 13C - NMR cho các pic cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 30 carbon, trong đó có hai carbon của nhóm exometylen [ δc 151,0(s, C-20) và 109,5(t, C-29)], một carbon của nhóm –COOH [ δc 179,4(s, C-28)] và một carbon sp3 mang oxygen [ δc 78,9(d, C-3)].
Tổng hợp các số liệu trên cho thấy chất AFD3 có cơng thức phân tử là C30H48O3 với độ bất bão hòa bằng 7. Trừ đi một nối đôi C=C của nhóm exometylen và một nhóm –COOH thì hợp chất này phải có 5 vịng. Do đó có thể kết luận hợp chất này là một triterpen acid mang một nhóm exometylen, một nhóm metyl vinyl, một nhóm –OH tự do và 6 nhóm metyl. Ngồi ra sự hiện diện của nối đơi exometylen và một nhóm metyl vinyl cho thấy trong phân tử có nhóm isopropenyl [δc 151,0(s, C-20) và 109,5(t, C-29) và 19,1(q, C-30)].
Các số liệu phổ trên phù hợp với số liệu phổ của acid bentulinic trong các tài liệu [14].
Axít bentulinic được phân lập từ rất nhiều lồi thực vật như Cornus florida, Axit betulinic
hoạt tính sinh học lý thú của nó như hoạt tính kháng HIV, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, kháng sốt rét, chống ung thư. Axit betulinic là tác nhân ức chế cọn lọc đối với các u ác tính ở người bằng cách gây ra hiện tượng apoptosis. Trong nghiên cứu kháng khuẩn kháng nấm, axit betulinic ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm khác nhau với MIC trong vùng 12-47 µg/ml. Tốt nhất với chủng
Microsporum canis (12 µg/ml) [14].
Bảng 3.5: 13C – NMR của các chất AFL2 và AFD3 (CDCl3) và (CDCl3 + CD3OD)
Chất C
Axit betulinic Friedelan - 3 - one
1 t38,8t 22,3 2 27,1t 41,5t 3 78,9d 213,1s 4 38,7s 58,3d 5 55,3d 42,1s 6 18,3t 41,3t 7 34,3t 18,3t 8 40,7s 53,1d 9 50,5d 37,5s 10 37,1s 59,5d 11 20,9t 35,7t 12 25,5t 30,5t 13 38,3d 39,7s 14 42,4s 38,3s 15 30,6t 32,5t 16 32,2t 36,0t 17 56,2t 30,0s 18 46,9d 42,9d
19 49,5d 35,4t 20 150,6s 28,2s 21 29,6t 32,8t 22 37,2t 39,3t 23 27,9q 6,8q 24 15,3q 14,7q 25 15,9q 17,9q 26 16,0q 20,3q 27 14,6q 18,7q 28 179,3s 32,1q 29 109,4t 35,0q 30 19,3q 31,8q • Chất AFD6 : artochamin B
AFD6 được tách ra từ cây có dạng bột vàng cấu trúc vơ định hình, có cơng thức phân tử là C25H24O7 được xác định nhờ các phổ NMR, HMQC,HMBC.
Phổ 1H NMR của AFD6 trùng lặp với phổ 1H-NMR artochamin B [34], có tín hiệu proton của nhóm hydroxyl δ = 12,89(1H, s,OH), tín hiệu của một nhóm isoprenyl đóng vịng [δ= 6,08 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-11), δ= 5,45 (1H, br d, J= 9,5 Hz), và hai nhóm metyl singlet ở δ=1,93 và 1,69ppm. Tín hiệu của một nhóm
isoprenyl khơng đóng vịng có δ= 5,28ppm (1H, t, J = 6,5 Hz, H-17), tín hiệu δ= 3,52ppm (1H, dd, J = 7,5; 15Hz, H-16a) và 3,44 (1H, dd, J = 7,5; 15Hz, H-16b),
nhóm metyl δ 1,84 và 1,69ppm (mỗi 3H, br s)]. Phổ 1H NMR cũng cho thấy 3 tín hiệu singlet của vịng thơm tại δ 7,18ppm được gán cho H-4 (1H, s), δ= 6,35 và
6,21ppm được gán cho H-7 và H-10.
Cấu trúc phân tử của AFD6 được khẳng định rõ hơn dựa trên dữ liệu phổ
13C-NMR và các phổ 2D HMQC, HMBC phù hợp với các dữ liệu đã cơng bố trong tài liệu [34]. Do đó, cấu trúc phân tử của artochamin B (AFD6) được xác định là:
2,3,8,10-tetrahydroxy-11-(3-methyl-2-butenyl)-6-(2-methyl-1-propenyl)-6H,7H- [1]benzopyrano[4,3-b][1]benzopyran-7-one.
Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học của cây Mít lá đen được nghiên cứu ở Việt Nam. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao chiết diclometan cho thấy cây có chứa các hợp chất triterpenoid (axit bentulinic, friedelin), hợp chất steroid (β-sitosterol) và hợp chất flavon (artochamin B). Qua kết quả thử hoạt tính sinh học của cao chiết và các tài liệu tham khảo về các nhóm chất trên, có thể hy vọng đây chính là các hợp chất góp phần tạo nên hoạt tính của cây.