- Các tế bào đơn nhân thu được sau ly tâm được hòa tan trong dung d ch PBS chứa 0,5% FBS về thể tích tại 2-8oC theo tỷ lệ 80µl/107 tế bào
- Bổ sung 20µl CD4 và 20µl CD8 Microbead vào ống tế bào trên với tỷ lệ 20 µl/107 tế bào mix đều và ủ trong 15 phút tại 2-8oC
- Bổ sung thêm dung 2ml dung d ch đệm mix đều và ly tâm ống tế bào tại 300×g trong 10 phút. Lọai bỏ d ch nổi, thu cặn tế bào.
- Bổ sung dung d ch đệm để đạt mật độ 108 tế bào/500µl
- Nhỏ tồn bộ tế bào trên từ từ đi qua cột từ LS (Miltenyi Đức) được cố đ nh trên giá từ. Lưu ý: cột từ phải được rửa bằng dung d ch đệm rửa trước khi cho tế bào đi qua. Tại đây các tế bào được gắn marker CD4 và CD8 sẽ được giữ lại trên cột từ.
- Rửa cột bằng dung d ch rửa 3 lần (3ml/lần) để loại bỏ các thành phần bám trên cột từ không đặc hiệu.
- Đưa cột từ ra khỏi giá từ, nhỏ 5ml dung d ch rửa lên cột từ dùng pittong đẩy mạnh, d ch chảy qua là dung d ch chứa tế bào Lympho T cần phân tách.
- Ly tâm ống tế bào chứa tế bào Lympho T tại 270×g trong 8 phút, loại bỏ d ch nổi và thu cặn tế bào, sử dụng cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
2.3.9. Đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế bào lympho T
- Tế bào Lympho T phân lập từ máu ngoại vi được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE-Thermo Scientific) trước khi cảm ứng với DC và Exosome trong đĩa nuôi cấy 12 giếng với mật độ 5mM/106 tế bào.
- Tế bào Lympho T cảm ứng với DC/DCno theo tỷ lệ tế bào Lympho T:DC/DCno = 4:1 trong môi trường KBM 551 chứa 50U/ml IL-2 với mật độ 6×105
tế bào/giếng. Lặp lại mỗi giếng 3 lần (Bảng 2.5)
- Exosome cũng được cảm ứng với cùng số lượng tế bào lympho T cảm ứng với DC/DCno theo tỷ lệ 1:4 về thể tích. Lặp lại mỗi giếng 3 lần (Bảng 2.5)
- Tế bào được nuôi cấy 4 ngày tại 37oC trong 5% CO2, bổ sung thêm 1/2 môi trường ban đầu nuôi cấy mỗi hai ngày/lần.
- Kết thúc ni cấy đo cường độ tín hiệu huỳnh quang CFSE là cách chỉ th gián tiếp số lần phân chia tế bào Lympho T trên máy phân tích tế bào theo dịng chảy Navious
Bảng 2.5: Thiết kế thí nghiệm tế bào Lympho T cảm ứng với DC và Exosome trên đĩa 12 giếng trên đĩa 12 giếng
Đĩa 1:
Tcell-DC Tcell-DCno DC only Med
Tcell-DC Tcell-DCno DC only Med
Tcell-DC Tcell-DCno DC only Med
Đĩa 2:
Tcell-Exo Tcell-Exono Tcell only Tcell-Exo Tcell-Exono Tcell only Tcell-Exo Tcell-Exono Tcell only Trong đó:
Tcell-DC: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC cảm ứng kháng nguyên
Tcell-DCno: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC không cảm ứng kháng nguyên
Tcell-Exo: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exo từ môi trường ni cấy DC có cảm ứng kháng ngun
Tcell-Exono: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exo từ môi trường nuôi cấy DC không cảm ứng kháng nguyên
DC only: Môi trường nuôi cấy chỉ chứa tế bào DC
Tcell only: Môi trường nuôi cấy chỉ chứa tế bào Lympho T
2.3.10. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng
- Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các tế bào lympho T sau cảm ứng với DC/DCno và Exo/Exono được thực hiện trên đĩa 96 giếng, thể tích mỗi giếng V=150µl
- Tế bào ung thư phổi A549 đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Calcein-AM (DoJindo, Japan), cấy lên đĩa với mật độ ban đầu là 3.000 tế bào/giếng
- Tế bào lympho T sau khi cảm ứng với DC/DCno và Exo/Exono được bổ sung vào đĩa với các tỷ lệ tế bào lympho T/A549 lần lần là 12,5:1, 25:1, 50:1 trong môi trường RPMI 1640. Mỗi tỷ lệ được lặp lại 3 lần.
- Sau thời gian 2 giờ ủ trong 37ºC, 5% CO2, tế bào được ly tâm tại 50×g, 2 phút. Hút bỏ 80µl mơi trường cũ bổ sung 80µl mơi trường mới mix đều sau đó ly tâm tại 50×g, 2 phút
Bảng 2.6: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào A549 của tế bào Lympho T bào Lympho T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B Med Pos
Tcell-DC Tcell-DCno Tcell only
C Med Pos D Med Pos 50 25 12.5 50 25 12.5 50 25 12.5 E Tcell-Exo Tcell-Exono F Neg Neg G Neg Neg 50 25 12.5 50 25 12.5 H Trong đó:
Pos=positive control: Giếng chứa tế bào A549 trong môi trường RPMI 1640 sau đó được bổ sung DCN90
Neg=negative control: Giếng chứa tế vào A549 trong môi trường RPMI 1640
- Tỷ lệ chết của tế bào ung thư được xác đ nh bằng cường độ tín hiện huỳnh quang trước và sau khi ủ bằng máy đo huỳnh quang Terascan VPC2 (Minervatech - Nhật Bản) theo công thức:
% cytotoxicity =
x 100
2.3.11. Phƣơng pháp phân tích tế bào theo dịng chảy
- Tại thời điểm ngày 0, ngày 5, ngày 7 DC được xác đ nh tỷ lệ kháng nguyên bề mặt bằng các kháng thể gắn huỳnh quang và máy đếm dòng chảy tế bào bao gồm CD14, CD40, CD56, CD80, CD86, HLA-DR
- Tế bào Lympho T máu ngoại vi được phân tích các kháng nguyên bề mặt gồm CD3, CD4, CD8 (Miltenyi Biotec) sau khi phân lập bằng máy đếm dòng chảy tế bào - Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm FlowJo v.X.0.7
- Các bước tiến hành:
Chuẩn b tế bào: Ly tâm tế bào tại 300×g trong 5 phút, loại bỏ d ch nổi. Pha loãng tế bào bằng PBS để đạt mật độ 106 – 3×106 tế bào/ml
Chuẩn b các ống chứa kháng thể như bảng 2.7
Bảng 2.7: Kháng thể sử dụng trong phƣơng pháp phân tích tế bào theo dịng chảy
(Ghi chú: KT - Kháng thể) Mẫu Ống IgG Ống 1 Ống 2 Ống 3 1. MNC phân lập từ máu xuống rốn 2. mDC Isotype control IgG1-FITC KT kháng HLA.DR-FITC Isotype control IgG1-PE KT kháng CD80- PE KT kháng CD40-PE KT kháng CD86-PE Isotype control IgG2a-PC7 KT kháng CD14- PC7 1. MNC phân lập từ máu ngoại vi Isotype control
Isotype control IgG1-FITC KT kháng CD8-FITC Isotype control IgG2a-PC7 KT kháng CD3-Vioblue
Thể tích 4µl mỗi loại 4µl mỗi loại 4µl mỗi loại 4µl mỗi loại
Bổ sung 100 μl tế bào vào mỗi ống chứa kháng thể, trộn đều và ủ trong tối 15-30 phút
Bổ sung dung d ch ly giải hồng cầu đối với mẫu MNC phân lập từ máu cuống rỗn trữ đông và máu ngoại vi
Bổ sung vào mỗi ống chứa tế bào 2ml PBS 1X, trộn đều và ly tâm ở 300×g trong 5 phút, loại bỏ d ch nổi, thu tế bào.
Bổ sung 300μl PBS trộn đều và đưa các ống vào máy flow cytometry và chạy chương trình phân tích
2.3.12. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Kết quả dấu ấn bề mặt tế bào được phân tích bằng phần mềm Flowjo vX.07
- Các dữ liệu được phân tích theo phương pháp thống kê Student‘s t-test. Tr số p < 0,05 biểu th sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thƣ A549
- Thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thư A549 được thực hiện sau 10 chu kỳ làm lạnh trong nito lỏng và rã đông trong bể ổn nhiệt 37oC, tiến hành nhuộm tế bào với trypan blue theo tỷ lệ 1:1 và kiểm tra dưới kính hiển vi để xác đ nh tỷ lệ sống chết. Kết quả quan sát thấy tỷ lệ chết của tế bào đạt 100%, tuy nhiên vẫn còn một số tế bào chưa b phá vỡ màng
- Ly tâm để thu lấy d ch nổi chứa protein tổng số tế bào. D ch nổi được lọc qua màng lọc 0 2 µm để loại bỏ vi khuẩn và các yếu tố gây nhiễm, nếu có.
- Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 595nm để lập đường chuẩn và tính nồng độ protein A549.
- Kết quả tách chiết protein tổng số trong 3 lần thực hiện thí nghiệm như sau:
Lần 1: 1,518 μg/ml
Lần 2: 1,910 μg/ml
Lần 3: 1,403 μg/ml
- Sau khi tách chiết, dung d ch protein được chia nhỏ vào các ống eppendorf 1,5ml và được bảo quản trong PBS ở -80 oC để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
- Một số nghiên cứu sử dụng peptide thương mại với mục đích cảm ứng kháng nguyên đặc hiệu với tế bào tua cũng như Exosome tiết từ tế bào tua.. Tuy nhiên liệu pháp này vẫn còn một số nhược điểm như việc sử dụng các peptide thương mại không bao quát được hết các kháng ngun ung thư cũng như khơng hoạt hóa được các tế bào miễn d ch T và B. Một số nghiên cứu đã cho thấy chính các Dex cảm ứng với protein ung thư chứ không phải Dex cảm ứng bằng peptide, mới có khả năng kích thích đáp ứng miễn d ch ở tế bào TCD4+ và tế bào B [45]. Vì vậy để khắc phục nhược điểm trên, trong nghiên cứu này các tế bào tua sẽ được cảm ứng với các protein ung thư thay vì các peptide ung thư.
3.2. Rã đông máu cuống rốn trữ đông
- Bốn mẫu máu cuống rốn trữ đông được rã đông tại các thời điểm khác nhau, sử dụng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng với Ficoll để thu lớp Buffy coat. Tỷ trọng của Ficoll (1 077) cao hơn tỷ trọng của tế bào đơn nhân nhưng nó lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu. Vì vậy, trong quá trình ly tâm, hồng cầu sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm, tế bào đơn nhân sẽ nằm ở mặt trên lớp Ficoll. Số lượng tế bào đơn nhân sau khi phân lập từ máu cuống rốn trữ đông được kiểm tra tỷ lệ sống chết bằng thuốc nhuộm Trypan Blue.
- Kết quả tỷ lệ tế bào sống ở các lần rã đông máu cuống rốn như sau:
Lần 1: 24,29%
Lần 2: 22,06%
Lần 3: 37,7%
Lần 4: 27,6%
Sau khi rã đông máu cuống rốn trữ đông tỷ lệ tế bào sống đạt 27.9 6.9 %
- Kết quả tỷ lệ sống tế bào đơn nhân sau bốn lần rã đông tương tự nhau, khoảng 30%. Tuy nhiên, kết quả này còn tương đối thấp so với kết quả nghiên cứu trước đây của Antoniewicz-papis và cộng sự (2013) [6]. Quan sát màu sắc lớp Buffy coat sau ly tâm máu cuống rốn trữ đơng nhận thấy lớp này có màu đỏ nhạt (Hình 2.4), là màu sắc của tế bào hồng cầu. Sự xuất hiện của tế bào hồng cầu (tế bào chết trong quá trình rã đơng) trong lớp Buffy coat làm tăng giả số lượng tế bào đơn nhân vì vậy giảm tỷ lệ sống tế bào thu được sau q trình rã đơng.
3.3. Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông
- Tế bào đơn nhân MNC sau khi xác đ nh tỷ lệ sống chết được nhuộm với thuốc nhuộm Turck để xác đ nh số lượng tế bào. Dung d ch Turck chứa chất nhuộm màu tím gentian và 1-2% axit acetic, có tác dụng phá hủy màng tế bào hồng cầu và bắt màu với nhân của các tế bào bạch cầu. Vì vậy, MNC sẽ bắt màu tím, các tế bào hồng cầu khơng nhân khơng bắt màu thuốc nhuộm (hình 3.1)
Hình 3.1: Tế bào trên buồng đếm hồng cầu khi nhuộm với thuốc nhuộm Turck
Mũi tên đỏ: tế bào MNC bắt nhuộm thuốc màu tím; Mũi tên vàng: hồng cầu khơng bắt màu thuốc nhuộm; Mũi tên xanh: các mảnh vỡ xác tế bào hoặc tiểu cầu. - Số lượng MNC thu được kết quả như sau: (Bảng 3.1)
Bảng 3.1: Số lƣợng MNC thu đƣợc từ máu cuống rỗn trữ đông
Mẫu Số lượng tế bào sống (× 106) Số lượng MNC (× 106) Tỷ lệ (%) MNC/tế bào sống 1 323 156 48,29 2 316 142 44,94 3 850 387 45,53 4 263 126 47,91
- Dựa theo kết quả thí nghiệm, MNC chiếm tỷ lệ từ 44 94% đến 48,29% trong tổng số tế bào lớp Buffy coat, còn lại là một lượng lớn tế bào hồng cầu, quan sát rõ ràng trên buồng đếm tế bào (Hình 3.1)
- Gieo tế bào đơn nhân vào chai nuôi cấy với mật độ 2×106 tế bào/ml mơi trường KBM 551. Sau 2 giờ, thu tế bào bám dính và loại bỏ d ch nổi mơi trường nuôi cấy.
Dựa theo quan sát, một lượng lớn tế bào trôi nổi đã được loại bỏ là các tế bào lympho, hồng cầu và tế bào mono khơng bám dính. Phần tế bào quan sát trên chai nuôi cấy là các tế bào mono đã bám dính (Hình 3.2)
Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trƣớc và sau khi loaị bỏ tế bào trôi nổi sau 2 giờ nuôi cấy
A: Tế bào đơn nhân nuôi cấy trước khi loại bỏ d ch nổi; B: Tế bào mono bám dính sau 2 giờ ni cấy được loại bỏ d ch nổi µ
- Để xác đ nh tỷ lệ phân lập tế bào đơn nhân bằng phương pháp bám dính tế bào đơn nhân trước và d ch nổi tế bào sau khi phân lập được phân tích dịng chảy tế bào (Flow cytometry). Dựa theo hai chỉ số: kích thước tế bào (forward scatter – FSC) và độ phức tạp nhân (side scatter – SSC), tỷ lệ tế bào mono bám dính được xác đ nh là hiệu số tế bào đơn nhân trước phân lập và tế bào đơn nhân từ d ch nổi môi trường ni cấy (Hình 3.3) bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy. Cụ thể, phần trăm tế bào mono được xác đ nh trước thời gian ủ 2 giờ trong môi trường KBM 551 chiếm tỷ lệ cao hơn so với phần trăm tế bào mono có trong d ch nổi tế bào.
- Hiệu suất phân lập tế bào mono qua q trình phân lập bằng phương pháp bám dính là 35,8±11,3 (bảng 3.2) theo cơng thức:
Hình 3.3: Quần thể tế bào trƣớc và sau khi phân lập tế bào mono
Monocytes_pre: tế bào mono trước khi phân lập. Monocytes_post: tế bào mono từ d ch nổi tế bào
Bảng 3.2: Hiệu suất phân lập tế bào mono
GTTB: giá tr trung bình ĐLC: độ lệch chuẩn Mẫu Tỷ lệ tế bào mono trƣớc khi phân lập (%) Tỷ lệ tế bào mono dịch nổi tế bào (%)
Hiệu suất phân lập monocytes (%) 1 10,1 6,1 40,1 2 11.8 5.8 50,8 3 28,4 20,5 27,8 4 16,9 9,5 43,8 Trung bình (GTTB ĐLC) 19,0±8,5 11,9±7.6 35,8±11,3
3.4. Kết quả biệt hóa tế bào mono thành tế bào DC 3.4.1. Hình thái tế bào 3.4.1. Hình thái tế bào
- Tế bào mono trong q trình ni cấy được quan sát hình thái ở 3 giai đoạn để thấy rõ sự thay đổi về hình dạng tế bào mono trong mơi trường biệt hóa thành tế bào DC:
Giai đoạn 1: Ngày 1, sau khi phân lập tế bào mono
Giai đoạn 2: Ngày 6, sau 6 ngày ni cấy biệt hóa tế bào mono thành DC chưa trưởng thành (iDC) (chưa bổ sung TNF-α) quan sát hình thái của DC, DCno và so sánh với tế bào mono.
Giai đoạn 3: Ngày 7, sau 7 ngày ni cấy biệt hóa tế bào mono thành DC (bổ sung TNF-α) quan sát hình thái của DC/DCno và so sánh với iDC
- Tế bào mono là tế bào có dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét sẽ thấy rõ các gờ trên bề mặt. Trong nghiên cứu này, khi quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi vào ngày 0, tế bào mono là các tế bào bám dính, có dạng trịn, khơng có màu kích thước khá đồng nhất đường kính trung bình 10µm (Hình 3.2B). Sau 3 ngày nuôi cấy tế bào trong môi trường KBM 551 có chứa GM-CSF và IL-4, một nửa mơi trường mới được bổ sung thay thế cho một nửa môi trường cũ.