Mũi tên đỏ: tế bào MNC bắt nhuộm thuốc màu tím; Mũi tên vàng: hồng cầu khơng bắt màu thuốc nhuộm; Mũi tên xanh: các mảnh vỡ xác tế bào hoặc tiểu cầu. - Số lượng MNC thu được kết quả như sau: (Bảng 3.1)
Bảng 3.1: Số lƣợng MNC thu đƣợc từ máu cuống rỗn trữ đông
Mẫu Số lượng tế bào sống (× 106) Số lượng MNC (× 106) Tỷ lệ (%) MNC/tế bào sống 1 323 156 48,29 2 316 142 44,94 3 850 387 45,53 4 263 126 47,91
- Dựa theo kết quả thí nghiệm, MNC chiếm tỷ lệ từ 44 94% đến 48,29% trong tổng số tế bào lớp Buffy coat, còn lại là một lượng lớn tế bào hồng cầu, quan sát rõ ràng trên buồng đếm tế bào (Hình 3.1)
- Gieo tế bào đơn nhân vào chai nuôi cấy với mật độ 2×106 tế bào/ml môi trường KBM 551. Sau 2 giờ, thu tế bào bám dính và loại bỏ d ch nổi môi trường nuôi cấy.
Dựa theo quan sát, một lượng lớn tế bào trôi nổi đã được loại bỏ là các tế bào lympho, hồng cầu và tế bào mono khơng bám dính. Phần tế bào quan sát trên chai nuôi cấy là các tế bào mono đã bám dính (Hình 3.2)
Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trƣớc và sau khi loaị bỏ tế bào trôi nổi sau 2 giờ nuôi cấy
A: Tế bào đơn nhân nuôi cấy trước khi loại bỏ d ch nổi; B: Tế bào mono bám dính sau 2 giờ ni cấy được loại bỏ d ch nổi µ
- Để xác đ nh tỷ lệ phân lập tế bào đơn nhân bằng phương pháp bám dính tế bào đơn nhân trước và d ch nổi tế bào sau khi phân lập được phân tích dịng chảy tế bào (Flow cytometry). Dựa theo hai chỉ số: kích thước tế bào (forward scatter – FSC) và độ phức tạp nhân (side scatter – SSC), tỷ lệ tế bào mono bám dính được xác đ nh là hiệu số tế bào đơn nhân trước phân lập và tế bào đơn nhân từ d ch nổi môi trường ni cấy (Hình 3.3) bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy. Cụ thể, phần trăm tế bào mono được xác đ nh trước thời gian ủ 2 giờ trong môi trường KBM 551 chiếm tỷ lệ cao hơn so với phần trăm tế bào mono có trong d ch nổi tế bào.
- Hiệu suất phân lập tế bào mono qua quá trình phân lập bằng phương pháp bám dính là 35,8±11,3 (bảng 3.2) theo cơng thức:
Hình 3.3: Quần thể tế bào trƣớc và sau khi phân lập tế bào mono
Monocytes_pre: tế bào mono trước khi phân lập. Monocytes_post: tế bào mono từ d ch nổi tế bào
Bảng 3.2: Hiệu suất phân lập tế bào mono
GTTB: giá tr trung bình ĐLC: độ lệch chuẩn Mẫu Tỷ lệ tế bào mono trƣớc khi phân lập (%) Tỷ lệ tế bào mono dịch nổi tế bào (%)
Hiệu suất phân lập monocytes (%) 1 10,1 6,1 40,1 2 11.8 5.8 50,8 3 28,4 20,5 27,8 4 16,9 9,5 43,8 Trung bình (GTTB ĐLC) 19,0±8,5 11,9±7.6 35,8±11,3
3.4. Kết quả biệt hóa tế bào mono thành tế bào DC 3.4.1. Hình thái tế bào 3.4.1. Hình thái tế bào
- Tế bào mono trong q trình ni cấy được quan sát hình thái ở 3 giai đoạn để thấy rõ sự thay đổi về hình dạng tế bào mono trong mơi trường biệt hóa thành tế bào DC:
Giai đoạn 1: Ngày 1, sau khi phân lập tế bào mono
Giai đoạn 2: Ngày 6, sau 6 ngày ni cấy biệt hóa tế bào mono thành DC chưa trưởng thành (iDC) (chưa bổ sung TNF-α) quan sát hình thái của DC, DCno và so sánh với tế bào mono.
Giai đoạn 3: Ngày 7, sau 7 ngày ni cấy biệt hóa tế bào mono thành DC (bổ sung TNF-α) quan sát hình thái của DC/DCno và so sánh với iDC
- Tế bào mono là tế bào có dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét sẽ thấy rõ các gờ trên bề mặt. Trong nghiên cứu này, khi quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi vào ngày 0, tế bào mono là các tế bào bám dính, có dạng trịn, khơng có màu kích thước khá đồng nhất đường kính trung bình 10µm (Hình 3.2B). Sau 3 ngày ni cấy tế bào trong mơi trường KBM 551 có chứa GM-CSF và IL-4, một nửa môi trường mới được bổ sung thay thế cho một nửa môi trường cũ. Tại thời điểm này, xuất hiện tế bào lớn về kích thước khơng đồng đều ở cả bề mặt bám dính và trong d ch nổi. Sau 24 giờ tiếp theo, tế bào được bổ sung (hoặc không bổ sung) protein tổng số từ dịng tế bào ung thư biểu mơ phổi A549. Vào ngày thứ 6 dưới sự kich thích của protein đóng vai trị là các kháng ngun, tế bào được cảm ứng có kích thước lớn hơn xuất hiện các tua ngắn đường kính khoảng 25µm là các DC chưa trưởng thành (Hình 3.4A). Tiếp tục bổ sung vào môi trường nuôi cấy TNF-α. Tại ngày thứ 7, một lượng lớn tế bào xuất hiện dạng mỏng có hai đi dài rõ rệt, trong khi một số tế bào xuất hiện hình thái với nhiều tua dài khơng đồng nhất như hình sao (Hình 3.4B 3.4C). Sau 24 giờ ni cấy dưới sự kích thích của TNF-α q trình tưởng thành DC từ iDC thành mDC đã diễn ra với sự gia tăng về kích thước tế bào cũng như chiều dài các tua (trung bình từ 10-40µm).
Hình 3.4: Hình thái tế bào mono biệt hóa thành tế bào DC
A: tế bào DCnon với kích thước lớn, tua ngắn (ngày thứ 6); B, C: tế bào DC trưởng thành vào ngày thứ 7 với (B) kích thước lớn, hai tua dài hoặc (C) kích
thước lớn, nhiều tua ngắn.
- Trong nghiên cứu này, DC biệt hóa từ tế bào mono máu cuống rốn trữ đơng có dạng mỏng đi dài tương tự như DC được mô tả bởi Alia M. Aldahlawi và cộng sự miêu tả vào năm 2016 khi nuôi cấy tế bào trong mơi trường KBM 551 có bổ sung GM-CSF và IL-4 [2]. Các tế bào hình sao đã được miêu tả ở những báo cáo trước trong nghiên cứu của Smita Nair, Hui-Jun Yi và Guang-Xiu Lu, Nowruz Delirezh và cộng sự [21, 44, 73]. Dựa trên các loại và nồng độ cytokine được sử dụng cũng như thời gian ni cấy, hình thái DC có sự đa dạng khác nhau.
3.4.2. Các dấu ấn bề mặt tế bào
- Để xác đ nh sự biệt hóa của tế bào đơn nhân thành tế bào tua, ngồi việc quan sát hình thái tế bào qua kính hiển vi, tại thời điểm nuôi cấy tế bào mono ngày đầu tiên, tế bào iDC ngày 6 và tế bào mDC ngày 7, tế bào được xác đ nh các dấu ấn bề mặt bởi các kháng thể bề mặt bao gồm CD14, CD80, HLA-DR, CD40, CD56, CD11c, CD123 bằng phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy (Hình 3.5B). Dựa vào hai chỉ số FSA và FSW để loại bỏ các tế bào chết và các tế bào kích thước lớn hơn tế bào đơn nhân. Sau đó phân biệt quần thể tế bào lympho và quần thể tế bào mono dựa vào chỉ số Forward scatter – FSC và Side scatter – SSC, quần thể tế đã có sự thay đổi rõ rệt về kích thước cũng như độ phức tạp nhân (Hình 3.5A). Các tế bào
mono ngày D1 tập trung trong một vùng nhất đ nh trong khi đó quần thể tế bào ngày D7 phân bố rộng khơng đồng nhất.
Hình 3.5: Phân tích theo phƣơng pháp dịng chảy tế bào các dấu ấn bề mặt tế bào
vào ngày D1, D6 và D7
Hình 3.5A: Tập hợp tế bào đơn được xác đ nh bằng hai chỉ số FSA và FSW và phân biệt tế bào lympho và tế bào mono bằng FSC và SSC. Hình 3.5B: Mức độ phần trăm biểu hiện các dấu ấn bề mặt lần lượt như: CD14, CD80, HLA-DR, CD40, CD56, CD86, CD11c, CD123. Viết tắt: CD: Cluster of differentiation.
- Dựa theo kết quả nghiên cứu, tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt được biểu hiện như bảng. So với tế bào mono ngày D1, iDC và mDC cho thấy sự gia tăng đáng kể trong biểu hiện của các dấu bề mặt như HLA-DR, CD11c, CD40, CD80 và CD86, giảm biểu hiện marker CD14 (dấu ấn bề mặt tế bào mono) và CD56 (dấn ấn bề mặt tế bào NK). Vào ngày D7, các tế bảo biểu hiện cao các dấu ấn CD40, CD80, CD86, HLA-DR và CD11c như bảng 3.3 . Kết quả này cũng tương tự như các kết quả của một số nghiên cứu khác [32].
Bảng 3.3: Giá trị trung bình các dấu ấn bề mặt biểu hiện trên tế bào tua ở giai đoạn nuôi cấy ngày (Đơn vị: %)
CD14 CD80 HLR-DR CD40 CD56 CD86 CD11c CD123
Day 1 4,78 2,37 19,02 11,6 8,2 4,47 1.02 1,56
Day 6_iDc 2,56 62,6 47,3 39,3 6,06 67,12 25,9 6,36
Day 7_mDc 1,55 80,4 79,2 41,9 5,31 80,6 40,9 8,21
- Xét về hình thái và kháng nguyên bề mặt DC đã được biệt hóa thành cơng từ tế bào mono máu cuống rốn trữ đơng. Tuy nhiên hình thái và mức độ biểu hiện các marker bề mặt là khác nhau, tùy thuộc vào mơi trường ni cấy, yếu tố kích thích, và thời gian ni cấy. Ví dụ độ biểu hiện của HLA-DR trong q trình biệt hóa DC là cao hơn khi sử dụng đồng thời hai yếu tố kích thích TNF-α và MCM so với sử dụng TNF-α một mình [21]. Magdalena Szarynska đã chứng minh rằng nồng độ LPS hoặc IFN-γ được sử dụng càng cao thì mức độ biểu hiện CD80 càng lớn trong q trình biệt hóa và trưởng thành DC tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi và máu cuống rốn [61].
Hình 3.6: Tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt.
Tế bào đơn nhân máu cuống rốn trữ đông được ni cấy trong 7 ngày và phân tích bằng các dấu hiệu ấn bề mặt khác nhau bằng phương pháp tế bào học dịng chảy. Sai số chuẩn trung bình được biểu hiện trong mỗi cột
3.5. Kết quả phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi
- Tế bào mono máu ngoại vi người khỏe mạnh được phân lập dựa theo phương pháp ly tâm theo tỷ trọng bằng Ficoll. Từ tế bào mono, phân tách quần thể tế bào lympho T bằng bộ kit Microbeads Human Kit MACS (Miltenyi Biotec, Inc., Germany) theo phương pháp lựa chọn dương tính hai dấu ấn bề mặt tế bào lympho là CD4 và CD8, để đánh giá mức độ tăng sinh độc tính của của tế bào Lympho T khi đồng nuôi cấy với các điều kiện kích thích khác nhau.
- Quần thể tế bào thu được sau khi phân tách bằng cột gắn từ được kiểm tra tỷ lệ sống chết và độ tinh sạch bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy. Thuốc nhuộm 7-amino-actinomycin D (7AAD) dùng để phân biệt tỷ lệ sống chết của tế bào. Là một loại thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết với DNA sợi đôi trong tế bào tại vùng giàu cặp bazo nito G-C, 7ADD bắt màu với tế bào chết do không bắt cặp DNA khi màng tế bào cịn ngun vẹn. Sau đó các dấu ấn CD3 (dấu ấn đặc trưng cho tế
0 20 40 60 80 100 120 HLR-DR CD14 CD11c CD80 CD40 CD86 CD56 CD123 Tỷ lệ % tr un g bìn h biểu h iện d ấu ấ n bề m ặt Tỷ lệ trung bình dấu ấn bề mặt
bào Lympho T) CD4 CD8 được dùng để xác đ nh độ tinh sạch cũng như quần thể tế bào T gây độc (CTLs) và T bổ trợ (Th) trong tổng số tế bào thu được (Hình 3.7). - Theo kết quả phân tích từ nghiên cứu, quần thể tế bào lympho T có độ tinh sạch rất
cao với tỷ lệ CD3 chiếm 98,7 ± 0,5%.
Hình 3.7 Phân tích quần thể tế bào lympho T bằng phƣơng pháp tế bào theo dịng chảy
Phân tích tế bào đơn dựa trên hai chỉ số FSA và FSH. Tỷ lệ tế bào sống sau đó được xác đ nh là các tế bào dương tính với 7-AAD trong quần thể tế bào Lympho. Các tế bào T CD4+ và CD8+ được phân biệt với nhau trong quần thể tế bào T CD3+. Các số hiển th trên hình ảnh là tỷ lệ phần trăm của quần thể tế bào.
3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế bào lympho T tế bào lympho T
- Để xác đ nh khả năng kích thích tăng sinh tế bào lympho T của các Exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC và DCno, các tế bào lympho T máu ngoại vi người khỏe mạnh được nhuộm với thuốc nhuộm Carboxyfluorescein succinimidyl ester CFSE sau đó đồng ni cấy với các Exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC,
DCno máu cuống rốn trữ đơng. CFSE là thuốc nhuộm có tính xun màng, khơng màu và không phát huỳnh quang khi nhóm acetate được loại bỏ bởi các esterases nội bào trong các tế bào sống. Khi b phân cắt, CFSE liên kết cộng hóa tr với nhóm amin có trong tế bào thơng qua nhóm succinimidyl ester và phát tín hiệu huỳnh quang tại bước sóng kích thích 490nm. CFSE tồn tại ở trong các tế bào sống và giảm một nửa tín hiệu huỳnh quang tại các thể hệ phân bào tiếp theo.
Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ khi nhuộm CSFE.
Tế bào Lympho T được phân chia hai lần trong thời gian đồng nuôi cấy 7 ngày với DC đã được cảm ứng kháng nguyên A549 và phân chia một lần với DC không được cảm ứng với kháng nguyên (DCno) hoặc Exosome phân lập từ DC (Exo). Các tế bào Lympho T không được đồng nuôi cấy với DC/Exosome hoặc các tế bào Lympho T được ủ với các Exosome được phân lập từ môi trường nuôi cấy DC không cảm ứng với kháng nguyên A549 (Exono) không phân chia. (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC, T cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exono. T cell: tế bào Lympho T được nuôi cấy độc lập)
- Các phản ứng tăng sinh của các tế bào lympho T được xác đ nh bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence intensity FI) CFSE. Kết quả nghiên cứu cho thấy (Hình 3.8) các tế bào lympho T khi đồng ni cấy với DC cảm ứng với protein A549 (T cell_DC) có tỷ lệ tăng sinh cao nhất, với sự phân chia lớn gấp hai lần trong 7 ngày nuôi cấy khi so sánh với các tế bào lympho T được ủ với DC không cảm ứng với protein A549 (Tcell_DCno). Các tế bào lympho T đồng nuôi cấy với Exosome phân lập từ DC (Tcell_Exo) cũng có số lượng tế bào tăng sinh gấp 2 lần.
Tuy nhiên, không ghi nhận thấy sự phân chia khi quan sát các tế bào Lympho T nuôi cấy độc lập (Tcell), là các tế bào Lympho T khơng có khả năng tăng sinh in vitro khi khơng có sự kích thích.
- Kết quả sự tăng sinh tế bào lympho T đồng lồi trong cả hai trường hợp đồng ni cấy tế bào Lympho T với DC và DCno tương tự như báo cáo trước đây [25]. Qing Ge và cộng sự đã chứng minh rằng tế bào lympho T tăng sinh mạnh khi tỷ lệ đồng nuôi cấy với DC là 2,5: 1 hoặc 5:1. Hơn nữa Nowruz el đã chứng minh rằng DC có thể kích thích các tế bào Lympho T đồng loài bằng khả năng trình diện kháng nguyên của chúng, phù hợp với các đặc tính của DC như quá trình tiết ra các cytokine đáp ứng miễn d ch [9]. Sự tăng sinh gấp 2 lần ở nhóm tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC được kích thích kháng nguyên A549 (Tcell_DC) so với nhóm lympho T đồng nuôi cấy với DC không được cảm ứng với kháng nguyên A549 (Tcell_DCno) đã chỉ ra rằng khả năng trình diện kháng nguyên của DC tốt hơn khi được cảm ứng với tác nhân lạ. Kết quả cũng tương tự như trong nghiên cứu cứu của Miwa và đồng nghiệp [67].
- Từ kết quả tăng sinh gần 2 lần tế bào lympho T khi đồng nuôi cấy với Exo tiết từ tế bào DC có cảm ứng kháng nguyên (Tcell_Exo) so với tế bào lympho T khi đồng nuôi cấy với Exo tiết từ tế bào DC không cảm ứng kháng nguyên và tế bào Lympho T ni cấy độc lập, có khả năng Exosome biểu hiện các kháng nguyên A549 lên bề mặt và kích thích sự tăng sinh tế bào lympho T khi trình diện các kháng ngun đó, bao gồm cả tế bào tế bào lympho T CD4+ và CD8+. Kết cuả đồng quan điểm với Charlotte Admyre và cộng sự khi chứng minh sự tăng sinh của tế bào CD8+ khi