CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen của human adenovirus
ADN của virut được tách chiết sử dụng bộ kít thương mại “The Viral Gene-Spin Virus RNA/DNA Isolation Kit” của hãng iNtRon. Quy trình tách chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đầu tiên hút 150 μl mẫu dịch bệnh lâm sàng vào một ống Eppendorf 1,5 ml mới, rồi bổ sung thêm 250 μl Lysis buffer, lắc đều trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phịng trong 10 phút. Sau đó, thêm 350 μl Binding buffer vào ống và trộn đều hoàn toàn bằng cách lắc nhẹ nhàng. Chất đệm Binding buffer giúp gắn ADN lên màng silica của cột tách chiết. Dich ly giải được chuyển lên cột đặt trong một ống eppendorf 2 ml rồi đem ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút với thời gian 1 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch trong ống và đặt cột trở lại. Sử dụng 500 μl dung dịch đệm Washing buffer A và ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 13000 vịng/phút để loại bỏ các thành phần khơng phải ADN (protein, lipid, muối...) còn bám trên màng. Tiếp tục rửa màng cột với 500 μl dung dịch Washing buffer B và đem ly tâm 1 phút ở tốc độ 13000 vòng/phút. Thêm một lần ly tâm khô để đảm bảo ethanol có trong đệm Washing được loại bỏ hồn tồn, khơng làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm sau này (PCR).
Thu thập mẫu bệnh phẩm
Tinh sạch DNA virut
PCR khuếch đại các đoạn gene hexon, penton và fiber
Tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR
So sánh với cơ sở dữ liệu để nhận diện chủng HAdV
Sau đó chuyển cột sang một ống Eppendorf 1,5 ml mới trước khi thêm 30-60 μl dung dịch Elution. Elution được cho trực tiếp lên màng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm khoảng 1 phút ở tốc độ 13.000 vòng/phút thu dung dịch chứa hệ gen ADN của virut.
Kiểm tra dịch tách chiết bằng điện di gel agarose 1%. Dung dịch tách chiết được bảo quản cẩn thận để sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen mong muốn.