CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. phương pháp nghiên cứu
2.2.3. PCR khuếch đại các đoạn gen hexon, penton vàfiber
Mẫu ADN đã tách chiết được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại một phần gen hexon dài khoảng hơn 600 bp, một phần gen penton và toàn bộ gen
fiber với kích thước tương ứng là 1118 bp và 1264 bp.
Các phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ở trên (bảng), mỗi phản ứng được thực hiện trong ống PCR 0,2 ml với tổng thế tích các thành phần là 20 µl, sử dụng máy PCR GenAtlas và BioMetra. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) dH2O 6 - 7 Primer F (10 pmol/µ) 0,5 Primer R (10 pmol/µ) 0,5 Mastermix 2X 10
ADN mẫu bệnh đau mắt đỏ 0,5
Total Volume 20,0
(*) Lượng ADN được thay đổi dựa theo nồng độ và chất lượng của từng mẫu ADN tách được.
Điều kiện phản ứng PCR
Gen Hexon: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Biến tính ban đầu: 95OC 2 phút
Chu trình nhiệt: 35 chu kỳ
o Biến tính: 95OC 10 giây
o Gắn mồi: 57OC 10 giây
o Kéo dài: 72OC 15 giây
Kéo dài bổ sung: 72OC
Gen Penton: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Biến tính bước đầu: 95OC 2 phút
Chu trình nhiệt: 35 chu kỳ
o Biến tính: 94OC 30 giây
o Gắn mồi: 61OC 30 giây
o Kéo dài: 72OC 30 giây
Kéo dài bổ sung: 72OC
Gen Fiber: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Biến tính bước đầu: 95OC 2 phút
Chu trình nhiệt: 35 chu kỳ
o Biến tính: 94OC 30 giây
o Gắn mồi: 57OC 45 giây
o Kéo dài: 72OC 1 phút
Kéo dài bổ sung: 72OC
Điện di sản phẩm PCR
Các đoạn gen hexon (vùng HVR-7 kích thước khoảng 600 bp) và penton
(1118 pb),fiber (1264 bp) thuộc các vùng siêu biến sau khi được được khuếch đại bằng phản ứng PCR đem kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1%.
Chuẩn bị gel agarose 1% bằng cách hịa tan hồn tồn 0,25 gam agarose trong 25ml TAE đệm 1X rồi quay trong lị vi sóng cho tới khi agarose tan hết. Để
gel nguội đến khoảng 60°C - 70°C thì thêm 1μl chất nhuộm DNA RedSafe. Đổ gel có chất nhuộm vào khuôn, cắm lược rồi đợi khoảng 10-15 phút cho gel đơng hồn toàn. Đem bản gel đặt vào bể, đổ đệm TAE 1X ngập 0,5 cm so với bản gel.
Tra mẫu, đầu tiên trộn 2 µl sản phẩm PCR + 1 µl dye 3X rồi tra mỗi sản phẩm vào một giếng tương ứng, cắm điện cực và điện di ở điện áp 90V trong 30 phút. Sau đó, lấy bản gel ra đặt dưới tia cực tím với bước sóng 360nm và chụp lại ảnh lưu trữ.