CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.6. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng PCR
PCR là phƣơng pháp đơn giản với giá thành không cao thƣờng đƣợc ứng dụng trong các phép đo nhanh, thử lần một để có câu trả lời dƣơng tính hay âm tính đối với một mẫu bệnh phẩm.
Bằng việc sử dụng các đoạn ADN mồi đặt hiệu, các quá trình nhiệt của phản ứng nhân đơi ADN đƣợc tối ƣu hóa và cho tiến hành trong thời gian từ 2 giờ đến 3 giờ. Các mẫu sau khi kết thúc phản ứng PCR đƣợc tra vào các giếng điện di để xác định sự có mặt của ADN vi khuẩn gây bệnh. Do trong quá trình chạy PCR đã sử dụng mồi IS6110 của hãng Invitrogen đối với ADN của vi khuẩn lao nên tính đặc hiệu rất cao. Nếu trong vaccine BCG hay trong mẫu bệnh phẩm mà cụ thể ở đây là mẫu đờm lao có chứa ADN của vi khuẩn lao, chúng sẽ đƣợc nhân lên nhiều lần và sẽ biểu hiện dƣơng tính ở trên gel điện di. Ngƣợc lại, nếu khơng có ADN của vi khuẩn lao trong mẫu sẽ không hiện phổ vạch trên bản điện di agarose.
Nhằm đánh giá độ chính xác đồng thời kiểm tra hiệu quả của quy trình gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng lao, chúng tơi tiến hành phản ứng PCR với khuôn là sản phẩm ly giải trong quy trình gắn kết từ mẫu ban đầu là vaccine BCG và mẫu đờm lao. Với mẫu ban đầu là vaccine BCG thì
enzyme sử dụng là Taq ADN polymerase, còn với mẫu bệnh phẩm ban đầu là mẫu đờm lao thì enzyme đƣợc sử dụng là ADN Dream taqTM
polymerase của hãng Fermentas. Sử dụng nƣớc cất hai lần làm đối chứng âm. Mỗi phản ứng gồm các thành phần sau :
Bảng 2.2. Các thành phần trong phản ứng PCR với vaccine BCG Thành phần Thể tích (µl)
H2O cất khử trùng, khử ion 12,5 µl
Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl
Hỗn hợp dNTP (2 mM) 2,5 µl
Mồi xi (25 ng/µl) 1 µl
Mồi ngƣợc (25 ng/µl) 1 µl
ADN Taq polymerase (5 unit/µl) 0,5 µl
ADN khn 5 µl
Tổng thể tích phản ứng 25 µl
Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR với mẫu đờm lao Thành phần Thể tích (µl)
H2O cất khử trùng, khử ion 12,8 µl
Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl
Hỗn hợp dNTP (2 mM) 2,5 µl
Mồi xi (25 ng/µl) 1 µl
Mồi ngƣợc (25 ng/µl) 1 µl
ADN Dream taqTM polymerase (5 unit/µl) 0,2 µl
ADN khn 5 µl
Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh cẩn thận về nhiệt độ ủ, thời gian ủ và thời gian kéo dài nhƣ ở bảng 2.4 dƣới đây.
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
40 chu trình
Giai đoạn biến tính 94oC – 1 phút Giai đoạn gắn mồi 65oC – 45 giây
Giai đoạn kéo dài 72oC – 1 phút
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.