CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG
THỂ KHÁNG LAO
Theo đánh giá của chúng tôi, việc tạo đƣợc liên kết gắn kết giữa hạt nano từ với kháng thể thông qua cầu nối EDC đã rất thành công mà minh chứng là ứng dụng nghiên cứu, thử nghiệm trên mẫu vaccine BCG và mẫu đờm lao đạt kết quả cao. Tuy nhiên, các phức hệ sinh học rất dễ biến đổi nếu không đƣợc áp dụng các biện pháp bảo quản thích hợp. Bên cạnh đó, nhằm hƣớng tới việc chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện vi khuẩn lao chúng tôi đã tiến hành bảo quản phức hệ trong dung dịch PBS-TBN (Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01% Tween20; 0,1% và 0,05 M NaN3) và tiến hành đánh giá độ bền vững của phức hệ trong dung dịch bảo quản này qua các mốc thời gian : 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày theo quy trình hình 3.12.
Các dịch trong thu đƣợc sau ly giải đƣợc bảo quản ở 4oC, đến ngày thứ 28 tất cả các mẫu đƣợc tiến hành chung trong một phản ứng PCR.
Hình 3.13. Kết quả đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể với mẫu vaccine BCG
Giếng (-) : Đối chứng âm
Giếng M : Thang chuẩn ADN 1 kb Giếng (+) : Đối chứng dương
Giếng 1-8 : Kết quả đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể tại các mốc thời gian 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày
Kết quả điện di ở hình 3.13 cho thấy tất cả các mốc thời gian đều xuất hiện băng ADN nhân bản có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho vi khuẩn lao, có nghĩa là phức hệ hạt từ gắn kháng thể bền vững trong dung dịch bảo quản PBS-TBN hay nói cách khác dung dịch PBS-TBN rất thích hợp cho việc lƣu giữ phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể.
Sau khi nghiên cứu độ bền vững của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể trong dung dịch bảo quản PBS-TBN đối với mẫu vaccine BCG chúng tôi cũng tiến hành
thử nghiệm tại ngày 28 với một mẫu đờm lao và kết quả cũng rất thành cơng khi xuất hiện băng ADN nhân bản có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho MTB. Kết quả thể hiện ở hình 3.14.
Hình 3.14. Thử nghiệm độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể với mẫu đờm lao
Giếng (-) : Đối chứng âm
Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương
Giếng 1 : Thử nghiệm mức độ bền vững của phức hệ đối với mẫu đờm lao tại ngày 28 Giếng 2 : Phần dịch còn lại của mẫu đờm lao tại ngày thử nghiệm 28
Theo nhiều nghiên cứu thì PBS-TBN là dung dịch thƣờng đƣợc sử dụng để bảo quản những phức hệ sinh học. Cơng trình nghiên cứu của Ambrosino E. và cộng sự [8] đã cho thấy rằng PBS-TBN có tác dụng lƣu giữ hoạt tính của phức hệ giữa peptide bắt nguồn từ protein Starp trong hồng cầu Plasmodium falciparum với hạt đã đƣợc bọc bởi một lớp kháng nguyên đƣợc 01 tháng, giữa peptide bắt nguồn từ các protein Lsa1, Lsa3, Glurp, Salsa, Trap, CSP và Pf11.1 trong hồng cầu
Anopheles gambiae với hạt đã đƣợc bọc bởi một lớp kháng nguyên đƣợc 03 tháng.
Đáng chú ý là phức hệ này cũng đƣợc tạo thông qua cầu nối trung gian EDC và NHS. Chính vì vậy, có thể nói kết quả đạt đƣợc trong việc sử dụng dung dịch PBS-TBN lƣu giữ độ bền vững của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể kháng lao có ý rất quan trọng trong việc định hƣớng phát triển bộ sinh phẩm phát hiện sớm vi khuẩn lao, góp phần phịng và chống lao trên đất nƣớc Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới.
KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận nhƣ sau:
1. Đã xây dựng đƣợc quy trình sử dụng hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đốn vi khuẩn lao trên đối tƣợng vaccine BCG, trong đó đã gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng lao với việc sử dụng cho 1 phản ứng là 71µl đệm PBS pH 6,5; 2µl kháng thể kháng lao (7 mg/ml); 2 µl EDC (250 mg/ml), hỗn hợp đƣợc ủ ở 22oC trong 30 phút cho phép phát hiện BCG ở nồng độ 4x10-5
mg/ml.
2. Đã thử nghiệm thành công các điều kiện tối ƣu trên của quy trinh trên các mẫu bệnh phẩm (đờm lao), sử dụng cặp mồi đặc hiệu IS6110 và ADN Dream taqTM polymerase. 100% mẫu bệnh lao dƣơng tính đƣợc chẩn đốn có kết quả trùng với kết quả của Viện Quân Y 103.
3. Phức hệ hạt nano từ gắn kết với kháng thể kháng lao qua cầu nối EDC đƣợc bảo quản trong dung dịch PBS-TBN có độ bền đến ngày thứ 28 khi thử nghiệm với mẫu vaccine BCG và mẫu đờm lao.
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Tiếp tục thử nghiệm độ chính xác của quy trình chẩn đốn vi khuẩn lao bằng hạt từ nano đã đƣợc chức năng hóa bề mặt trên số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm nhiễm lao, đồng thời mở rộng trên các đối tƣợng vi khuẩn, virus khác.
2. Tiến tới chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện vi khuẩn lao và phối hợp với các phòng xét nghiệm của các bệnh viện để thử nghiệm ứng dụng hạt nano từ đƣợc chức năng hóa bề mặt chẩn đốn các bệnh liên quan đến vi khuẩn lao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ Y tế (2012), Báo cáo tổng kết chương trình phịng chống lao quốc
gia, Hội nghị tổng kết công tác chống lao giai đoạn 2007 - 2011, định hƣớng hoạt
động giai đoạn 2012 – 2015, Hà Nội ngày 24 tháng 03 năm 2012.
2. Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hịa (2005), Vi sinh vật Y học, NXB
Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Nguyễn Việt Cồ, Trần Văn Sáng, Ngô Ngọc Am, Lê Ngọc Hƣng, Mai Văn Khƣơng, Nguyễn Xuân Nghiêm, Trần Thị Xuân Phƣơng (2006), Bệnh học lao, NXB Y học.
4. Nguyễn Hữu Đức, Trần Mậu Danh, Trần Thị Dung (2007), “Chế tạo và nghiên cứu tính chất từ của các hạt nano Fe3O4 ứng dụng trong y sinh học”, Tạp
chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ, 23, tr. 231-237.
5. Nguyễn Hồng Hải (2007), “Các hạt nano kim loại (Metallic nanoparticles)”, Tạp chí Vật lý Việt Nam, 1(1), tr. 7-10.
6. Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Châu, Nguyễn Hoàng Lƣơng, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa, Mai Anh Tuấn (2007), Ứng dụng của hạt nano ơxít sắt từ để tách chiết DNA, đếm tế bào bạch cầu, và cải tiến q trình xử lí nước nhiễm bẩn, Tuyển tập các báo cáo Hội nghị Vật lý Chất rắn toàn quốc lần thứ 5,
Vũng Tàu, 12-14/11/2007, tr.18-24.
TIẾNG ANH
7. Adikaram C.P., Perera J., Wijesundera S.S. (2012), “The manual mycobacteria growth indicator tube and the nitrate reductase assay for the rapid detection of rifampicin resistance of M. Tuberculosis in low resource settings”, BMC Infect. Dis.12: 326.
8. Ambrosino E., Dumoulin C., Orlandi-Pradines E., Remoue F., Toure A., Tall A., Sarr J.B., Poinsignon A., Sokhna C., Puget K., Jean T., Pascual A., Druilhe P., Fusai T., Rogier C. (2010), “A multiplex assay for the simultaneous
detection of antibodies against 15 Plasmodium falciparum and Anopheles gambiae saliva antigens”, Malar. J. 9: 317.
9. Amita J., Vandana T., Guleria R.S., Verma R.K. (2002), “Qualitative Evaluation of Mycobacterial DNA Extraction Protocols for Polymerase Chain Reaction”, Mol. Biol. Today 3: 43-50.
10. Arruebo M., Valladares M. (2009), “Antibody-Conjugated Nanoparticles for Biomedical Applications”, J. Nanomater. 2009: 1-24.
11. Awua A.K., Doe E.D., Gyamfi O.K. (2010), “Evaluation of cost- effective total nucleic acidsextraction protocols for cultured Mycobacterium
tuberculosis; a comparison by PCR amplification of genes associated with drug
resistance”, BMC Res. Notes 3:48
12. Bemer P., Palicova F., Rusch-Gerdes S., Dugeon H.B., Pfyffer G.E. (2002), “Multicentre evaluation of fully automatic BACTEC mycobacteria growth indicator tube 960 system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis”,
J. Clin. Microbiol. 40: 150-154.
13. Brighenti S., Lerm M. (2012), “How Mycobacterium tuberculosis Manipulates Innate and Adaptive Immunity – New Views of an Old Topic”,
Pathog. J. 4: 42-53.
14. Bruce I.J., Taylor J., Michael T., Martin J.D., Borioni E., Sangregorio C., Sen T. (2004), “Synthesis,characterisation and application of silica-magnetite nanocomposites”, J. Magnet. Magnet. Mater. 284: 145–160.
15. Campo A.D., Sen T., Lelluoche J.P., Bruce I.J. (2005), “Multifunctional magnetite and silica-magnetite nanoparticles: Synthesis, surface activation and applications in life science”, J. Magnet. Magnet. Mater. 293: 33–40.
16. Cole S. T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S. V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C. E., Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Krogh A., McLean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Osborne J., Quail M. A., Rajandream M.A.,
Rogers J., Rutter S., Seeger K., Skelton J., Squares R., Squares S., Sulston J. E., Taylor K., Whitehead S., Barrell B.G. (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature 393:
537-544.
17. Cousins D.V., Bastida R., Cataldi A., Quse V., Redrobe S., Dow S., Duignan P., Murray A., Dupont C., Ahmed N., Collins D.M., Butler W.R., Dawson D., Rodriguez D., Loureiro J., Romano M.I., Alito A., Zumarraga M. (2003), “Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
53: 1305-1314.
18. Eichbaum Q., Rubin E.J. (2002), “Tuberculosis: Advances in Laboratory Diagnosis and Drug Susceptibility Testing”, Am. J. Clin. Pathol. 118:
S3-S17.
19. Emovon O. (2009), “Current trends in the laboratory diagnosis of Tuberculosis”, Benin J. Postgrad. Med. 11: 80-90.
20. Hermanson G. T. (2008), Bioconjugate techniques 2nd Edition, San
Diego: Academic Press, 1202 p.
21. Kolk A.H.J., Kox L.F.F., Leeuwen J.V., Kuijper S.,Jansen H.M (1998), “Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis”, Eur. Res. J. 11: 1222–1226.
22. Kubica G.P., Dye W.E., Cohn M.L., Middlebrook G. (1963), “Sputum digestion and decontamination with N-Acetyl-l-cysteine sodium hydroxide for culture of bacteria”, Am. Rev. Resp. Dis. 87: 775–779.
23. Kumar N., Kumar P. (2011), “Nanotechnology: A focus on Treatment of Tuberculosis”, Int. J. Drug Del. 3: 25-42.
24. Letfullin R., Murphy B. (2011), “Application of plasmonic nanomaterials in Nanomedicine”, Nanomater.: Appl. Prop. 1: 92-96.
25. Mathuria J.P. (2009), “Nanoparticles in tuberculosis diagnosis, treatment and prevention: A hope for future”, Dig. J. Nanomater. Biostr. 4: 309 –
312.
26. Němečková I.. Solichová K., Roubal P., Uhrová B., Šviráková E. (2011), “Methods for Detection of Bacillus sp., B. Cereus and B. licheniformis in
Raw Milk”, Czech J. Food Sci. 29: S55–S60.
27. Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J. (2003), “Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine”, J. Physic. D: Appl. Physic
36: 167-181.
28. Pooja M.T., Komal V., Vida A., Shree R. (2011), “Functionalized Gold Nanoparticles and Their Biomedical Applications”, Nanomater. 1: 31-63.
29. Rai M., Yadav A., Gade A. (2009), “Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials”, Biotechnol. Adv. 27: 76-83.
30. Shi B., Xia X. (2003), “Morphological changes of Pseudomonas pseudoalcaligenes in response to temperature selection”, Current. Microbiol. 46:
120–123.
31. Shukla I., Varshney S., Malik A. (2011), “Evaluation of nested PCR targeting IS6110 of Mycobacterium tuberculosis for the diagnosis of pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis”, Biol. and Med. 3: 171-175.
32. Sounderya N., Zhang Y. (2008), “Use of Core/Shell Structured Nanoparticles for Biomedical Applications”, Rec. Pat. Biomed. Engin. 1: 34-42.
33. WHO (2012), Global Tuberculosis report, WHO report 2012.
34. Wu W., He Q., Jiang Q. (2008), “Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis and Surface functionalization strategies”, Nanoscale. Res. Lett. 3:397– 415.
TÀI LIỆU INTERNET 35. http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Mycobacterium_tuberculosis_Zi ehl-Neelsen_stain_02.jpg 36. http://www.rsc.org/chemistryworld/news/2007/october/18100702.asp 37. http://openi.nlm.nih.gov/ 38. http://www.thermoscientificbio.com/pcr-enzymes-master-mixes-and- reagents/dreamtaq-dna-polymerase/ 39. http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Dot%20blot%20protocol.pdf