Các chất ƣ́c chế protease HIV-1

Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.4. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ

1.4.1. Các chất ƣ́c chế protease HIV-1

Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS [13]. Những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc của protease HIV-1 ở dạng dimer và tính đặc hiệu của enzyme với cơ chất là cơ sở để thiết kế các chất ức chế protease một cách chính xác [19]. Nhìn chung, các chất tổng hợp hoá học đã đƣợc thiết kế ức chế đặc hiệu protease HIV-1, thuộc hai nhóm chính: i) các chất ức chế có bản chất peptide và ii) các chất ức chế khơng phải peptide [75]. Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ chất tự nhiên mang liên kết đặc hiệu của protease HIV-1. Chúng đƣợc thiết kế giống với dạng trung gian chuyển tiếp tứ diện hình thành trong quá trình protease xúc tác. Cấu hình này giúp cho chất ức chế gắn chặt vào trung tâm hoạt động của protease. Trong khi đó, nhóm chất ức chế khơng phải peptide lại gắn với phân tử H2O trong trung tâm hoạt động của protease làm cho protease không gắn đƣợc với các polyprotein tiền thân của HIV-1 để thực hiện chức năng của mình.

Do đƣợc thiết kế, các PI tổng hợp hố học này thƣờng có tính đặc hiệu cao nhƣng nhƣợc điểm là gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài và khả năng kháng thuốc cao. Vì vậy, sự ra đời của các loại thuốc PI mới chống HIV/AIDS là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, việc thiết kế các chất mới thƣờng khá phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc thử nghiệm và không thân thiện với con ngƣời. Chính vì vậy, bên cạnh các chất tổng hợp hóa học, các nhà khoa học cũng khơng ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên có tác dụng ức chế protease HIV-1.

Nhiều dịch chiết từ thực vật và vi sinh vật đã đƣợc sử dụng để chống nhiễm trùng, chống lại sự phát triển của các khối u cũng nhƣ có hoạt tính kháng HIV-1 và protease HIV-1 [55]. Ueba và tập thể đã nghiên cứu tác dụng của 30 dịch chiết thực vật lên hoạt động của HIV-1 và nhận thấy khả năng ức chế nhiều nhất là dịch chiết methanol của cây xà cừ Tây Ấn. 36 dịch chiết trong chloroform, methanol và nƣớc của một số thực vật ở Thái Lan đã đƣợc sử dụng để sàng lọc hoạt tính ức chế protease HIV-1. Kết quả cho thấy, các dịch chiết chloroform và MeOH từ thân, rễ của cây Ngãi bún (Boesenbergia pandurata) thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất chống lại protease HIV-1 [71]. Ở trong nƣớc, Nguyễn Văn Dũng và tập thể (2015) [2] đã sử dụng pepsin thay thế cho protease HIV-1 để đánh giá hoạt tính ức chế của 136 dịch chiết từ thực vật. Kết quả cho thấy, dịch chiết ethanol của hạt Bơ, lá Gối hạc, cây Ma hoàng, lá Ổi và lá Thạch châu ức chế mạnh hoạt tính của pepsin .

Từ các dịch chiết thực vật và vi sinh vật ban đầu, một loạt các hợp chất thứ cấp có khả năng ức chế protease HIV-1 đã đƣợc phân tách và tinh sạch. Các hợp chất tự nhiên có khả năng chống HIV đã đƣợc mơ tả thành từng nhóm dựa trên tính chất hóa học nhƣ các flavonoid có hoa ̣t tính chống oxi hóa có khả năng chống HIV - 1 [16, 63], các ligin [65]; các hợp chất phenol có khả năng chống v irus hiê ̣u quả thƣờng ngăn chă ̣n và làm giảm hấp thu ̣ của virus lên màng tế bào chủ thông qua liên kết với các protein của virus hoă ̣c bề mă ̣t của tế bào chủ [63]; đă ̣c biê ̣t, các triterpen và dẫn xuất của chúng đã đƣợc nghiên cứu nhiều và có tiềm năng ức chế mạnh protease HIV-1 [1]. Cụ thể, acid ursolic, acid maslinic và một số triterpen khác đã đƣợc phân lập từ nhiều nguồn thực vật khác nhau [1, 2, 30], trong đó acid maslinic thể hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1 mạnh nhất. Các nghiên cứu cũng chỉ ra vai trị quan trọng của nhóm carboxyl tại mạch bên C-3 và C-17 trong cấu trúc vòng của triterpen đã tƣơng tác với các gốc amino acid của protease qua liên kết hydrogen và tƣơng tác tĩnh điện, qua đó ức chế hoạt động của enzyme [30]. Cụ thể nhƣ, acid oleanoic phân lập từ dịch chiết methanol của gỗ cây Văn quan (Xanthoceras

sorbifolia) ức chế HIV-1 trong các tế bào H9 với IC50 là 1,7 µg/ml. Tuy nhiên, este

năng ức chế các tế bào H9 đã tăng lên đáng kể với IC50 là 0,0039 µg/ml và ức chế protease HIV-1 với IC50 là 10 mg/ml [63]. Khơng chỉ có ở thực vật, nhiều triterpen phân lập từ nấm Việt Nam và Trung Quốc cũng cho thấy hoạt tính ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 dao động từ 20 đến hơn 200 µM [31].

Bên cạnh tác dụng ức chế trực tiếp protease HIV-1, việc tìm ra các hoạt chất này cũng sẽ là cơ sở để thiết kế các chất hóa học có cấu trúc tƣơng tự nhƣng đƣợc cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu quả ức chế protease HIV-1. Một trong các ví dụ tiêu biểu phải kể đến là bevirimat (DSB, PA-457) hay acid 2,2-dimethyl succinic dẫn xuất của acid betulinic, đƣợc tạo ra trên cơ sở biến đổi cấu trúc của acid betulinic - acid đƣợc phân lập đầu tiên từ cây Trâm (Syzygium claviforum) - một loại thảo dƣợc của Trung Quốc với hoạt tính ức chế HIV cùng các triterpen khác. Bevirimat không nhƣ các chất ức chế protease HIV-1 khác, nó hoạt động bằng cách gắn vào protein gag tiền thân và ức chế quá trình phân cắt gag tạo các protein cấu trúc cần thiết cho HIV-1 hoàn chỉnh. Bevirimat đang đƣợc xem là một chất ức chế protease HIV-1 mới và chống AIDS khá tiềm năng vì nó ức chế q trình sao chép của cả HIV-1 và HIV-1 kháng thuốc ức chế reverse transcriptase và protease.

1.4.2. Ứng dụng chất ƣ́c chế protease HIV-1 trong điều tri ̣ HIV/AIDS

Những nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc, thành phần và chức năng của các protease HIV-1 là cơ sở tạo ra các PI đầu tiên vào những năm đầu thập kỷ 90. Thiết kế chất ức chế dựa trên các nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế thuỷ phân cơ chất của protease HIV-1 là ứng dụng lớn nhất của protease giúp kéo dài cuộc sống của bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Những chất ức chế này đã đƣợc cải biến bằng nhiều cách để ăn khớp chính xác vào trung tâm hoạt động của protease HIV-1 [39].

Cho đến nay, đã có 10 thuốc PI đƣợc FDA cấp phép để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV, bao gồm: Lopnavir (LPV), Atazanavir (ATV), Darunavir (DRV), Fosamprenavir (FPV), Tipravir (TPV), Amprenavir (APV), Indinavir (IDV), Nelfinavir (NFV), Saquinavir (SQV) và Ritonavir. (RTV) [77]. Để đánh giá mức độ

mạnh yếu của các chất ức chế các nhóm nghiên cứu trƣớc thƣờng sử dụng giá trị IC50, IC90 và IC95 (nồng độ của chất ức chế mà tại đó 50%, 90% và 95% hoạt tính của enzyme bị ƣ́c chế ). Để phát triển các chấ t ƣ́c chế thành thuốc , ngoài việc thử nghiê ̣m trong điều kiê ̣n in vitro thì các chất ức chế đƣợc thử nghiệm lâm sàng , thông qua phát hiê ̣n các thông số dƣợc đô ̣ng ho ̣c, bƣớc đầu thiết lâ ̣p hoa ̣t tính chống virus trong điều kiê ̣n in vivo, bằng cách xác đi ̣nh số bản sao của RNA HIV trong huyết tƣơng để đánh giá hiê ̣u quả hoa ̣t tính của chất ƣ́c chế . Các thuốc PI cho điều trị HIV/AIDS thƣờng đƣợc sử dụng theo đƣờng uống hoặc tiêm, trong đó, Indinavir, đƣợc phát triển bởi Merck & Co., là chất ức chế protease HIV thứ ba đƣợc cấp phép. Đây là một chất ức chế mạnh và chọn lọc của protease ở nồng độ 0,6 nM. Indinavir đƣợc tăng cƣờng độ hòa tan và hoạt tính sinh học theo đƣờng uống rất tốt và ức chế virus với nồng độ từ 50-100 nM [24]. Mặc dù vậy, có một số vấn đề liên quan đến Indinavir đó là thuốc gây sỏi thận ở khoảng 5-25% số bệnh nhân. Ngoài ra, thuốc cịn có tác dụng phụ trên da, niêm mạc và nhiều bệnh nhân bị tăng bilirubin không triệu chứng. Các thuốc PI khác cũng có hiệu lực kháng HIV cao và đặc hiệu, tuy nhiên tác dụng phụ và kháng thuốc vẫn là vấn đề lớn đối với điều trị bệnh nhân HIV/AIDS bằng PI nói riêng cũng nhƣ liệu pháp ARV (liệu pháp dùng thuốc kháng HIV) nói chung hiện nay. Chính vì vậy, các PI mới hiệu quả hơn cũng nhƣ các PI có nguồn gốc tự nhiên thân thiện với con ngƣời vẫn đang đƣợc sàng lọc và tìm kiếm.

Tuy nhiên, cho đến nay, chƣa một liệu pháp sử dụng các hợp chất tự nhiên nào đƣợc công nhận bởi các chuyên gia y tế cho phòng ngừa hoặc điều trị HIV/AIDS. Các sản phẩm tự nhiên hoặc thảo mộc chủ yếu đƣợc sử dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS nhằm hỗ trợ giúp ngƣời bệnh tăng cƣờng khả năng miễn dịch, nâng cao chất lƣợng cuộc sống hoặc đối phó với các tác dụng phụ do điều trị bằng liệu pháp ART gây ra. Dù vậy, các nghiên cứu về biến đổi cấu trúc triterpen đã dẫn đến tạo ra bevirimat và hiện nay, nhiều dẫn xuất triterpen khác hứa hẹn kháng virus vẫn đang đƣợc nghiên cứu bởi các nhà khoa học. Nhƣ vậy, tiềm năng có đƣợc một dẫn xuất mới cho thử nghiệm lâm sàng kháng HIV là tƣơng đối cao [31].

Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học cổ truyền. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cây thuốc Việt Nam có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý. Nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc , vị thuốc của Viê ̣t Nam sẽ là nguồn nguyên liệu phong phú cho viê ̣c sàng lọc và phát hiê ̣n ra các hoạt chất ức chế protease HIV -1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS.

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1. NGUYÊN LIỆU

- Enzyme protease HIV-1 tái tổ hợp là sản phẩm của đề tài mã số ĐT- PTNTĐ. 2012-G/02 [52].

- Cơ chất peptide cải biến mã số L6525 (Lys-Ala-Arg-Val-Nle-NPh-Glu- Ala-Nle-NH2) của hãng Sigma Aldrich (Mỹ)

- Cơ chất Peptide cải biến và cơ chất huỳnh quang Peptide HF đƣợc tổng hợp và tinh sạch bởi hãng Gencript (Mỹ) và Anaspec (Mỹ), 20 hơ ̣p chất thực vật thƣ́ sinh đƣơ ̣c cung cấp bởi Viê ̣n Dƣợc liệu Trung ƣơng.

- Các hoá chất khác đều đƣợc mua từ các hãng uy tín và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu.

2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ

Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: Máy ổn nhiệt khô Multi Block® Heater (Lab-Line Instruments), máy quang phổ khả kiến DU 800 (Beckman coulter), quang phổ kế huỳnh quang Nanodrop 3300 (Thermo Scientific) và nhiều máy móc thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U

2.3.1. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chất pep tide cải biến trên máy quang phổ khả kiến [60]

Nguyên tắc: Cơ chất Peptide cải biến chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dƣới dạng cải biến Nle và Nph có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 300 nm (A300). Dƣới tác dụng thủy phân của protease HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ kế UV-VIS DU800 (Beckman Coulter).

Tiến hành: Các thành phần của phản ứng (trừ protease HIV-1) đƣợc ủ trƣớc

ở 37oC trƣớc khi tiến hành trộn với nhau theo tỷ lệ đƣợc trình bày ở Bảng 3. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, tiến hành đo trên hệ thống máy quang phổ khả kiến DU800 của hãng Beckman Coulter tại bƣớc sóng A300 trong 5 phút ở 37oC.

Mơ ̣t đơn vi ̣ hoa ̣t đô ̣ protease HIV -1 là lƣợng enzyme chuyển hóa một micromole cơ chất thành sản phẩm trong 1 phút ở điều kiện phân tích.

Hoạt độ của protease HIV-1 đƣơ ̣c tính nhƣ sau: HĐ = A300 0 −A300 (5)

5 *Ccơ chất*300 (µmol/phút) Trong đó:

HĐ: hoạt độ của protease HIV-1

A300(0): Độ hấp thụ cơ chất tại bƣớc sóng 300 nm ở thời gian t=0 phút A300 (5): Độ hấp thụ cơ chất tại bƣớc sóng 300 nm ta ̣i thời gian t=5 phút Ccơ chất : Nờng đơ ̣ cơ chất (µM)

300 : Thể tích của phản ƣ́ng xác đi ̣nh hoa ̣t đơ ̣ (µl)

Bảng 3: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV-1 sƣ̉ du ̣ng cơ chất Peptide đặc hiệu cải biến

Thành phần Thể tích (μl)

H2O khử ion, khử trùng 128

Đê ̣m 2X (Na-acetate 200 mM, pH 4,7, EDTA 8 mM,

-ME 10 mM, NaCl 1,8 M, CaCl2 2 mM) 150

Cơ chất (1mg/ml) 20

Protease HIV-1 (150 ng/l) 2

Tổng thể tích 300

Đối với các phản ứng xác định tác dụng ức chế của các chất lên hoạt đô ̣ của protease HIV-1: Chất nghiên cứu đƣợc hoà tan trong dung mơi thích hợp (thƣờng là DMSO) và ủ trƣớc 2 phút với protease HIV -1, sau đó đệm và cơ chất mới đƣợc bổ sung để bắt đầu phản ứng xác định hoạt đơ ̣ cịn lại của enzyme . Thể tích các chất nghiên cứu bổ sung ln là 1 µl ở các nồng độ thích hợp vào tổng thể tích của phản ứng 300 µl để đạt nồng độ cuối cùng của chất nghiên cứu nhƣ mong muốn. Theo đó, nồng độ DMSO 100% để hoà tan các chất nghiên cứu đã bị pha loãng 300 lần nên khơng ảnh hƣởng đến hoạt tính của protease HIV-1. Hoạt độ của protease HIV-

cứu thay bằng 1 µl DMSO. Mƣ́c đơ ̣ ƣ́c chế (%) protease HIV-1 đƣợc tính dƣ̣a trên hoạt độ enzyme còn lại khi có mặt chất ức chế so với hoạt độ enzyme của mẫu kiểm tra không có chất ƣ́c chế (đƣợc xem là 100%).

2.3.2. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 bằng cơ chất huỳnh quang trên máy quang phổ kế huỳnh quang [33]

Nguyên tắc: Cơ chất của protease HIV-1 là một chuỗi peptide tổng hợp có vị

trí cắt đặc hiệu của enzyme. Một đầu peptide có gắn chất phát huỳnh quang HiLyte Fluor488 cịn đầu kia là chất thu tín hiệu huỳnh quang QXL 520. Trong điều kiện bình thƣờng , HiLyte Fluor 488 và QXL 520 ở tƣơng đối gần nhau (thƣờng 10- 100Å) nên khi có ánh sáng kích thích (excitation) tín hiệu huỳnh quang phát ra từ HiLyte Fluor 488 sẽ đƣợc QXL 520 thu lại. Dƣới tác dụng của hoạt tính protease HIV-1, liên kết đặc hiệu bị thủy phân, tín hiệu huỳnh quang phát ra từ HiLyte Fluor 488 sẽ đƣợc máy quang phổ thu lại (Hình 5). Kết quả sẽ cho tín hiệu huỳnh quang tăng dần theo thời gian.

Hình 5: Nguyên tắc xác định hoạt độ của protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Peptide HF

Tiến hành: Cơ chất HF của protease HIV -1 có trình tự QXL 520-GABA- SFNFPQITK-HiLyte Flour 488-NH2 đƣợc hoà tan ở nồng đô ̣ 0,5 mg/ml (tƣơng ứng 235 µM) trong Dimethyl sulfoxide (DMSO). Các thành phần của phản ứng (trừ protease HIV-1) (Bảng 4) đƣợc ủ ở 37oC trƣớc khi tiến hành trộn với nhau . Protease HIV-1 đƣợc bổ sung, trộn đều và đo giá tri ̣ Ex/Em (excitation/emission) ở bƣớc sóng tƣơng ƣ́ng 488 nm/520 nm (bằng máy quang phổ huỳnh quang ND 3000, Thermo

scientific) trong 5 phút ở 37oC. Mỗi phản ứng đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.

Bảng 4: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV-1 sƣ̉ du ̣ng cơ chất đặc hiệu huỳnh quang Peptide HF

Thành phần Thể tích (μl)

dd H2O khử ion, khử trùng 12

Đê ̣m 2X (CH3COONa 200 mM; NaCl 2 M; EDTA 2 mM; DTT

2 mM; DMSO 10%; BSA 1 mg/mL) 15

Cơ chất 0,1 mg/mL 2,0

Protease HIV-1 100 ng/L 1,0

Tổng thể tích 30

2.3.3. Xác đi ̣nh các hằng số đô ̣ng ho ̣c của protease HIV-1

Km hằng số Michaelis - Menten, phản ánh ái lực của enzyme và cơ chất , khi Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn , và hiệu quả phản ứng do enzyme xúc tác càng cao và ngƣợc lại. Trị số kcat là số phân tử cơ chất có thể đƣợc chuyển hóa thành sản phẩm bởi 1 phân tử enzyme trong 1 đơn vị thời gian. Tỷ lệ Kcat/Km là hiệu năng xúc tác của enzyme, cũng đƣợc dùng để so sánh tính đặc