NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U

2.1. NGUYÊN LIỆU

- Enzyme protease HIV-1 tái tổ hợp là sản phẩm của đề tài mã số ĐT- PTNTĐ. 2012-G/02 [52].

- Cơ chất peptide cải biến mã số L6525 (Lys-Ala-Arg-Val-Nle-NPh-Glu- Ala-Nle-NH2) của hãng Sigma Aldrich (Mỹ)

- Cơ chất Peptide cải biến và cơ chất huỳnh quang Peptide HF đƣợc tổng hợp và tinh sạch bởi hãng Gencript (Mỹ) và Anaspec (Mỹ), 20 hơ ̣p chất thực vật thƣ́ sinh đƣơ ̣c cung cấp bởi Viê ̣n Dƣợc liệu Trung ƣơng.

- Các hoá chất khác đều đƣợc mua từ các hãng uy tín và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu.

2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ

Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: Máy ổn nhiệt khơ Multi Block® Heater (Lab-Line Instruments), máy quang phổ khả kiến DU 800 (Beckman coulter), quang phổ kế huỳnh quang Nanodrop 3300 (Thermo Scientific) và nhiều máy móc thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U

2.3.1. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chất pep tide cải biến trên máy quang phổ khả kiến [60]

Nguyên tắc: Cơ chất Peptide cải biến chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dƣới dạng cải biến Nle và Nph có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sóng 300 nm (A300). Dƣới tác dụng thủy phân của protease HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ kế UV-VIS DU800 (Beckman Coulter).

Tiến hành: Các thành phần của phản ứng (trừ protease HIV-1) đƣợc ủ trƣớc

ở 37oC trƣớc khi tiến hành trộn với nhau theo tỷ lệ đƣợc trình bày ở Bảng 3. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, tiến hành đo trên hệ thống máy quang phổ khả kiến DU800 của hãng Beckman Coulter tại bƣớc sóng A300 trong 5 phút ở 37oC.

Mô ̣t đơn vi ̣ hoa ̣t đô ̣ protease HIV -1 là lƣợng enzyme chuyển hóa một micromole cơ chất thành sản phẩm trong 1 phút ở điều kiện phân tích.

Hoạt độ của protease HIV-1 đƣơ ̣c tính nhƣ sau: HĐ = A300 0 −A300 (5)

5 *Ccơ chất*300 (µmol/phút) Trong đó:

HĐ: hoạt độ của protease HIV-1

A300(0): Độ hấp thụ cơ chất tại bƣớc sóng 300 nm ở thời gian t=0 phút A300 (5): Độ hấp thụ cơ chất tại bƣớc sóng 300 nm ta ̣i thời gian t=5 phút Ccơ chất : Nờng đơ ̣ cơ chất (µM)

300 : Thể tích của phản ƣ́ng xác đi ̣nh hoa ̣t đơ ̣ (µl)

Bảng 3: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV-1 sƣ̉ du ̣ng cơ chất Peptide đặc hiệu cải biến

Thành phần Thể tích (μl)

H2O khử ion, khử trùng 128

Đê ̣m 2X (Na-acetate 200 mM, pH 4,7, EDTA 8 mM,

-ME 10 mM, NaCl 1,8 M, CaCl2 2 mM) 150

Cơ chất (1mg/ml) 20

Protease HIV-1 (150 ng/l) 2

Tổng thể tích 300

Đối với các phản ứng xác định tác dụng ức chế của các chất lên hoạt đô ̣ của protease HIV-1: Chất nghiên cứu đƣợc hoà tan trong dung mơi thích hợp (thƣờng là DMSO) và ủ trƣớc 2 phút với protease HIV -1, sau đó đệm và cơ chất mới đƣợc bổ sung để bắt đầu phản ứng xác định hoạt đơ ̣ cịn lại của enzyme . Thể tích các chất nghiên cứu bổ sung ln là 1 µl ở các nồng độ thích hợp vào tổng thể tích của phản ứng 300 µl để đạt nồng độ cuối cùng của chất nghiên cứu nhƣ mong muốn. Theo đó, nồng độ DMSO 100% để hoà tan các chất nghiên cứu đã bị pha loãng 300 lần nên khơng ảnh hƣởng đến hoạt tính của protease HIV-1. Hoạt độ của protease HIV-

cứu thay bằng 1 µl DMSO. Mƣ́c đơ ̣ ƣ́c chế (%) protease HIV-1 đƣợc tính dƣ̣a trên hoạt độ enzyme cịn lại khi có mặt chất ức chế so với hoạt độ enzyme của mẫu kiểm tra không có chất ƣ́c chế (đƣợc xem là 100%).

2.3.2. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 bằng cơ chất huỳnh quang trên máy quang phổ kế huỳnh quang [33]

Nguyên tắc: Cơ chất của protease HIV-1 là một chuỗi peptide tổng hợp có vị

trí cắt đặc hiệu của enzyme. Một đầu peptide có gắn chất phát huỳnh quang HiLyte Fluor488 cịn đầu kia là chất thu tín hiệu huỳnh quang QXL 520. Trong điều kiện bình thƣờng , HiLyte Fluor 488 và QXL 520 ở tƣơng đối gần nhau (thƣờng 10- 100Å) nên khi có ánh sáng kích thích (excitation) tín hiệu huỳnh quang phát ra từ HiLyte Fluor 488 sẽ đƣợc QXL 520 thu lại. Dƣới tác dụng của hoạt tính protease HIV-1, liên kết đặc hiệu bị thủy phân, tín hiệu huỳnh quang phát ra từ HiLyte Fluor 488 sẽ đƣợc máy quang phổ thu lại (Hình 5). Kết quả sẽ cho tín hiệu huỳnh quang tăng dần theo thời gian.

Hình 5: Nguyên tắc xác định hoạt độ của protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Peptide HF

Tiến hành: Cơ chất HF của protease HIV -1 có trình tự QXL 520-GABA- SFNFPQITK-HiLyte Flour 488-NH2 đƣợc hoà tan ở nồng đơ ̣ 0,5 mg/ml (tƣơng ứng 235 µM) trong Dimethyl sulfoxide (DMSO). Các thành phần của phản ứng (trừ protease HIV-1) (Bảng 4) đƣợc ủ ở 37oC trƣớc khi tiến hành trộn với nhau . Protease HIV-1 đƣợc bổ sung, trộn đều và đo giá tri ̣ Ex/Em (excitation/emission) ở bƣớc sóng tƣơng ƣ́ng 488 nm/520 nm (bằng máy quang phổ huỳnh quang ND 3000, Thermo

scientific) trong 5 phút ở 37oC. Mỗi phản ứng đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.

Bảng 4: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV-1 sƣ̉ du ̣ng cơ chất đặc hiệu huỳnh quang Peptide HF

Thành phần Thể tích (μl)

dd H2O khử ion, khử trùng 12

Đê ̣m 2X (CH3COONa 200 mM; NaCl 2 M; EDTA 2 mM; DTT

2 mM; DMSO 10%; BSA 1 mg/mL) 15

Cơ chất 0,1 mg/mL 2,0

Protease HIV-1 100 ng/L 1,0

Tổng thể tích 30

2.3.3. Xác đi ̣nh các hằng số đô ̣ng ho ̣c của protease HIV-1

Km hằng số Michaelis - Menten, phản ánh ái lực của enzyme và cơ chất , khi Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn , và hiệu quả phản ứng do enzyme xúc tác càng cao và ngƣợc lại. Trị số kcat là số phân tử cơ chất có thể đƣợc chuyển hóa thành sản phẩm bởi 1 phân tử enzyme trong 1 đơn vị thời gian. Tỷ lệ Kcat/Km là hiệu năng xúc tác của enzyme, cũng đƣợc dùng để so sánh tính đặc hiệu của enzyme với các cơ chất khác nhau.

Trong nghiên cứu này, các hằng số động học đƣợc tính theo hai phƣơng pháp: Theo phƣơng trình Michaelis – Menten:

Trong đó: V0: Vận tốc ban đầu của phản ứng Vmax: Vận tốc phản ứng cực đại Km: Hằng số Michaelis – Menten

Theo phƣơng trình Lineweaver - Burk:

Theo đó, phƣơng trình Lineweaver – Burk có dạng đƣờng thẳng tuyến tính y = ax + b, cắt trục tung ở điểm 1/Vmax và cắt trục hoành tại điểm -1/Km, qua đó dễ dàng xác định đƣợc các giá trị Km, Vmax. Phƣơng trình Lineweaver – Burk vẫn đƣợc dùng phổ biến hiện nay vì có thể nhận đƣợc các dẫn liệu thực nghiệm tốt với nhiều nồng độ cơ chất khác nhau, cho kết quả chính xác và tin cậy.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. THIẾT KẾ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA CƠ CHẤT PEPTIDE CHO XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1

Hiện nay, một số cơ chất đặc hiệu cho xác định hoạt tính của protease HIV-1 với trình tự amino acid khá đa dạng, đƣợc gắn với các nhóm chất hố học khác nhau đã đƣợc nghiên cứu và thƣơng mại hoá. Trong đó, cơ chất Peptide cải biến tại vị trí P1-P1' tạo liên kết có khả năng hấp thụ cực đại trong vùng tử ngoại; hoạt độ của protease HIV-1 đƣợc đánh giá dựa trên sự giảm độ hấp thụ của cơ chất theo thời gian trên máy quang phổ thơng thƣờng có thể phù hợp với nhiều phịng thí nghiệm. Dựa trên nguyên tắc này, chúng tôi tiến hành thiết kế cơ chất đặc hiệu cho protease HIV-1, sử dụng cho các phản ứng xác định hoạt tính và sàng lọc chất ức chế của enzyme.

3.1.1. Trình tự amino acid của cơ chất protease HIV-1

Cơ chất peptide cải biến thƣờng có trình tƣ̣ gồm 7 amino acid với các gớc tƣ̀ P4-P3’ [18], trong đó, P1 ln là Leu hoặc Nle và P1' là Nph để tạo liên kết hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng tử ngoại. Cơ chất này thƣờng đƣợc thiết kế tại vị trí p24/p2 trên polyprotein gag với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Ala-Glu-Ala-NH2 (* là vị trí cắt của protease HIV-1), Leu thƣờng đƣợc biến đổi thành Nle, Ala biến đổi thành Nph [60]. Cụ thể, Nle khơng có mạch bên R phân nhánh; Nph có chƣ́a nhóm NO2 là nhóm hút điê ̣n tƣ̉ làm cho liên kết CO*NH giữa CO của Nle và NH của N ph; trở nên lỏng lẻo hơn so với CO*NH của Leu và Nph, giúp tăng hiệu quả phân cắt cơ chất bởi enzyme. Bên cạnh đó, Nph có khả năng hấp thụ cực đại ánh sáng tại bƣớc sóng 300 nm giúp xác định đƣợc hoạt tính của protease trên cơ sở giảm độ hấp thụ ánh sáng của cơ chất.

Tuy nhiên, trên chuỗi polyprotein gag-pol tiền thân, vị trí P6pol-PR đƣợc phân cắt đầu tiên để giải phóng protease HIV-1 có hoạt tính cho các bƣớc thuỷ phân tại gag-pol và gag tiếp theo tạo các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho HIV-1 [22]. Mặt khác, theo Kausslich và tập thể cơ chất dựa trên trình tự cắt tại P6pol-PR

[59] cịn cho thấy một số cơ chất mang trình tự khác trên gag , gag-pol không bị protease HIV-1 cắt theo lý thuyết và không đƣợc dùng làm cơ chất nhƣng thực tế thí nghiệm lại có ái lực cao với trung tâm hoạt động của protease HIV-1 hơn cơ chất. Nghiên cứu cũng cho thấy, kích thƣớc, trình tự và đặc tính các amino acid đều ảnh hƣởng đến cấu hình và ái lực của cơ chất với trung tâm hoạt động của protease HIV-1. Do đó, có thể các trình tự phân cắt trên gag-pol tạo ra các enzyme (protease, reverse transcriptase và integrase) có ái lực hơn so với các vị trí khác trên gag.

Trong nghiên cứu này, với tiêu chí thiết kế cơ chất có ái lực và hiệu quả cắt cao bởi protease HIV-1, vị trí cắt tại RT -IN của gag -pol với trình tự Arg-Lys-Ile- Leu*Phe-Leu-Asp trên gag-pol đƣợc chúng tôi lựa chọn để thiết kế cơ chất peptide cải biến. Trong đó, tại P1*P1' là Leu*Phe đƣơ ̣c biến đổi thành Nle*Nph làm cho liên kết không bị thay đổi nhiều so với cấu trúc tự nhiên. Ngoài ra, bổ sung Gly- Nle-NH2 vào đầu C sẽ giúp cơ chất ổn định hơn (giá trị Km thấp và Kcat cao) [60]. Vì vậy, cơ chất Peptide cải biến của protease HIV-1 đƣợc thiết kế với trình tự: Ac-Arg- Lys-Ile-Nle*Nph-Leu-Asp-Gly-Nle-NH2 (ký hiệu Peptide CH). Cơ chất đƣợc đă ̣t tổng hợp bởi Genscript (Mỹ) với độ tinh sạch trên 95%.

3.1.2. Xác định một sớ đặc tính của cơ chất Peptide CH

3.1.2.1. Xác định n ồng độ enzyme thích hợp cho phản ứng xác định hoạt độ của

protease HIV-1

Trong phản ƣ́ng xác đi ̣nh hoa ̣t đô ̣ của bất kỳ enzyme nào , nồng đô ̣ enzyme phải phù hợp để có sự biến đổi tuyến tính giữa mức độ chuyển hóa cơ chất theo thời gian phản ƣ́ng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ enzyme protease HIV-1 phù hợp trong phản ứng thuỷ phân cơ chất Peptide CH. Kết quả thƣ̣c nghiê ̣m cho thấy nồng đô ̣ protease HIV -1 134 nM tƣơng đƣơng với 1 g trong

thể tích phản ƣ́ng là 300 µl là thích hợp nhất đối với phản ƣ́ng thủ y phân cơ chất CH (Hình 6). Theo các nghiên cƣ́u trƣớc đây , nồng đô ̣ protease HIV-1 phù hợp dao đô ̣ng trong khoảng 8-70 nM [6, 10] hoă ̣c 50-200 nM [34, 70], tùy thuộc vào kiểu cơ

thấy, phản ứng thuỷ phân Peptide CH của protease HIV-1 trong 5 phút sẽ đảm bảo mức độ tuyến tính của tốc độ với thời gian phản ứng nên đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 6: Ảnh hƣởng nờng đô ̣ protease HIV-1 đến tốc độ phản ứng sử dụng cơ chất Peptide CH

3.1.2.2. Xác định nồng độ thích hợp của cơ chất Peptide CH

Với nồng độ protease HIV-1 134 nM, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm với dải nồng độ Peptide CH từ 50-350 µM. Kết quả thu đƣơ ̣c (Hình 7) cho thấy nồng độ từ 50-60 µM vẫn đảm bảo mức độ tuyến tính của tốc độ hình thành sản phẩm; điều này chứng tỏ đây là nồng độ thích hợp cho phản ứng xác định hoạt tính của protease HIV-1 sử dụng cơ chất Peptide CH.

0.26 0.27 0.28 0.29 0.3 0 1 2 3 4 5 A­ 300 Thời gian (phút) 40,2 nM 67 nM 134 nM 201 nM 227,8 nM 268 nM 335 nM

Hình 7: Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất Peptide CH đến phản ƣ́ng thủy phân bởi protease HIV-1

Trên cơ sở sƣ̉ du ̣ng cơ chất Peptide CH để xác định tốc độ phản ứng của protease HIV-1, chúng tôi đã biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo phƣơng trình Michaelis - Menten và bƣớc đầu đánh giá hiệu quả xúc tác của enzyme qua các hằng số động học Km, Vmax và Kcat. Cụ thể, khi nồng độ Peptide CH tăng dần đến khi đạt giá trị tốc độ phản ứng đạt cực đại (Vmax), tƣ̀ đó chúng tơi tính đƣợc Km= [S] tại Vo=Vmax/2. Từ Vmax, biết đƣợc nồng độ enzyme tham gia phản ứng [Eo], tính đƣợc hiệu quả xúc tác của enzyme Kcat = Vmax/[Eo].

Dựa trên đồ thị Hình 7, chúng tơi đã tính đƣợc Vmax = (A300/t) cực đại =

0,0023 µmol/phút, từ đó xác định đƣợc Km =96,08 µM và Kcat =0,49 (giây)-1, Kcat/Km = 5,082 (mM*giây)-1. Tomaszek và tập thể [67] cũng đã thiết kế cơ chất Ac- Arg-Lys-Ile-Leu-Nph-Leu-Asp-Gly-NH2 dƣ̣a vào vi ̣ trí cắt tại RT /IN. Sử dụng cơ chất cho phản ứng xác định hoạt độ protease HIV-1 đã cho các giá trị Km=280 µM, Kcat =7,7 (giây)-1 và Kcat/Km=28 (mM*giây)-1, nhƣ vâ ̣y cơ chất Peptide CH có ái lƣ̣c cao hơn. Có thể amino acid tại vị trí P1đƣơ ̣c thay thế bằng Nle trong cơ chất Peptide CH đã cho hiệu quả cắt bởi protease HIV-1 cao hơn nghiên cứu này. Khi P1-P1' không bị cải biến, cơ chất Ile-Arg-Lys-Ile-Leu*Phe-Leu-Asp-Gly-NH2 có ái lực và hiệu quả phân cắt bởi enzyme cao hơn Peptide CH với các giá trị Km=6 µM, Kcat=1,2 (giây)-1, Km/Kcat=202 (mM*giây)-1. Tuy nhiên, cơ chất Ile-Arg-Lys-Ile-Leu*Phe-

y = 0.00088ln(x) - 0.00284 R² = 0.98378 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 50 150 250 350 A 30 0 Nồng độ Peptide CH (µM)

Leu-Asp-Gly-NH2 sử dụng phƣơng pháp xác định hoạt độ protease HIV -1 bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC và bản chất phƣơng pháp này cũng có độ nhạy cao [69]. Khi so sánh Peptide CH với peptide cải biến đƣợc thiết kế dựa trên vị trí cắt tại CA/NC trên gag với trình tƣ̣ Lys -Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Met có Km=22 µM và

Kcat=20 (giây)-1 [60]. Nhƣ vậy, cơ chất này có giá trị Kmthấp hơn 3,1 lần và Kcat cao

hơn 52,6 lần so với cơ chất Peptide CH . Tuy nhiên, kết quả so sánh sẽ tin cậy hơn khi các cơ chất đƣợc tiến hành đồng thời trong các thí nghiệm với cùng một loại enzyme protease HIV-1. Có thể, sƣ̣ khác nhau về trình tƣ̣ , kích thƣớc và bản chất của phƣơng pháp xác định hoạt độ đã ảnh hƣởng tới ái lực của cơ chất với protease HIV-1.

3.1.2.3. Xác định điều ki ện thích hợp của đệm cho phản ứng thuỷ phân Peptide

CH bởi potease HIV-1

Các thành phần và pH của đệm phản ứng có vai trị quan trọng đối với với phản ứng xác định hoạt độ của bất kỳ enzyme nào . Các yếu tố này thƣờng ảnh hƣởng đến độ bền , độ ổn định của cấu trúc, trạng thái ion hoá cơ chất hoặc trung tâm hoạt động của enzyme dẫn đến thay đổi ái lực của enzyme với cơ chất. Chúng tôi tiến hành phản ứng phân giải cơ chất Peptide CH bởi protease HIV-1 trong 2 loại đệm: đệm 1 (CH3COONa 100 mM, pH 4,7 có EDTA 4 mM, β-ME 5 mM, NaCl 0,9 M, CaCl2 5 mM) là đệm đã đƣợc sử dụng trong nghiên cƣ́u của Nguyen và