CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. LựA CHọN POLYMALTOSE VớI DE THÍCH HợP
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên cả bốn loại polymaltose P1, P2, P3 và P4 với DE trong khoảng 12-30. Kí hiệu mẫu HAP là HAP1, HAP2, HAP3 và HAP4 tƣơng ứng với 4 mẫu polymaltose P1, P2, P3 và P4.
Trong thí nghiệm này và tất cả các nghiên cứu về sau, HAP đều đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp kết tủa trực tiếp nhƣ đã lựa chọn trong phần 2.2.1.
Giản đồ XRD của các mẫu đƣợc cho trên Hình 3.4. Các giản đồ tƣơng tự nhau và đều chỉ ra sự tạo thành HA đơn pha trong mẫu HA chỉ có HA cũng nhƣ tất cả các mẫu HAP. Các vạch nhiễu xạ mở rộng do kích thƣớc rất nhỏ của các hạt HA, đặc biệt là trong các mẫu HAP.
Hình 3.4. Giản đồ XRD các mẫu HAP tổng hợp với DE khác nhau
Từ ảnh SEM của mẫu có thể thấy các hạt HA gần nhƣ hình trịn với kích thƣớc 20-30 nm. Tuy nhiên chúng sắp xếp thành chuỗi ngắn, rồi một số chuỗi lại dính nhau thành đám với kích thƣớc hai chiều khoảng 30-60 nm và 80-100nm.
Hình 3.5. Ảnh SEM của các mẫu HAP với polymaltose có DE khác nhau
Ảnh SEM của mẫu HAP1 và HAP2 với polymaltose DE 12-20 vẫn có sự kết đám rõ rệt của các hạt HA tƣơng tự nhƣ trong mẫu HAp. Trong mẫu HAP1, các đám hạt có kích thƣớc khá lớn chiều dài có thể tới 100nm, chiều rộng 40-60nm. Các đám kết tập này có xu hƣớng giảm đi đáng kể đối với mẫu HAP2, chiều rộng cịn khoảng 20-40nm. Trong khi đó, thấy rõ rằng với polymaltose có DE 25-30, các hạt HAP3 và HAP4 phân tán tốt hơn rõ rệt, phần lớn các hạt rời rạc với biên hạt rõ nét, kích thƣớc hạt khoảng 20-25nm.
Những quan sát từ ảnh SEM chỉ ra ảnh hƣởng của chất nền polymaltose đến hình thái hạt HA. Polymaltose, đặc biệt với DE 25-30, tạo ra sự phân tán khá đồng
HA HAP1 HAP2
nhất của các hạt HA.Kết luận này đƣợc khẳng định rõ hơn với kết quả chụp ảnh TEM (Hình 3.6).
Hình 3.6. Ảnh TEM của các mẫu HAP với giá trị DE khác nhau ở thang đo 100nm, độ phóng đại 60000x ở thang đo 100nm, độ phóng đại 60000x
Có những tập hợp dạng que chiều rộng khoảng 30-50nm và dài tới 100nm trên ảnh TEM của mẫu HAp, tƣơng ứng với các đám chuỗi hạt trên ảnh SEM.Với mẫu HAP1 mức độ tập hợp hạt có giảm đi. Tiếp theo, với mẫu HAP2, sự phân tán của các hạt HA đƣợc cải thiện nhiều hơn. Còn trên ảnh TEM của mẫu HAP3 và HAP4, mặc dù các hạt HA chƣa tách rời hồn tồn, nhƣng có thể phân biệt đƣợc hạt ở kích thƣớc rất nhỏ, khoảng 10-15nm.
Trong sự hình thành HA/polyme, vai trị của các polyme nói chung là cung cấp các vị trí tạo mầm và bằng cấu trúc, kiểm sốt hình thái và kích thƣớc các hạt nano HA cũng nhƣ phân bố của chúng trong mạng polyme. Nhƣ một số nghiên cứu đã chỉ ra, nồng độ của các nhóm cacboxyl, hydroxyl hay amin trong phân tử polyme có ảnh hƣởng rõ rệt đến tốc độ và cơ chế tạo mầm HA. Mật độ các vị trí tạo mầm cũng ảnh hƣởng đến kích thƣớc của các tập hợp hạt và hình thái của chúng [43].
Trong luận văn này, các polymaltose khác nhau về độ dài chuỗi phân tử và cấu trúc nhánh, đƣợc đặc trƣng bởi giá trị DE. Trong số 4 polyme, các mẫu P3 và P4 với DE cao nhất 25 đến 30, có nồng độ nhóm OH cao nhất , số vị trí tạo mầm lớn nhất, nên mức độ tập hợp hạt là nhỏ nhất. Quan trọng hơn, các polymaltose P3 và P4 đƣợc thủy phân dùng enzyme Promozyme cắt mạch nhánh amylopectin nên có cấu trúc chuỗi phân tử gần nhƣ chỉ còn lại mạch thẳng amylose. Trong khi đó, hai mẫu P1 và P2, cắt chủ yếu là mạch thẳng nên có cấu trúc vừa mạch thẳng và mạch nhánh. Sự khác nhau về DE tƣơng ứng với chiều dài và cấu trúc mạch phân tử polyme đã làm biến đổi các đặc trƣng của HAP tạo thành: khoảng không gian giới hạn sự phát triển của các hạt HA thu hẹp dẫn tới hạn chế sự phát triển và kết đám của các hạt HA.
Từ kết quả này khẳng định được rằng, polymaltose với DE 25-30 là thích hợp để tổng hợp HAP với kích thước hạt nhỏ và phân bố hạt tốt. Trong những nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sẽ sử dụng polymaltose với DE 25 vì polymaltose DE 30 với mức độ thủy phân cao quá trình phức tạp hơn, việc bảo quản cũng khó khăn hơn do mức độ hút ẩm tăng.
3.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của các thông số phản ứng đến sản phẩm HAP
3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng polymaltose
Thí nghiệm đƣợc thực hiện với các giá trị hàm lƣợng polymaltose ban đầu thay đổi trong khoảng 20-80%. Hàm lƣợng polymaltose thực tế trong các mẫu HAP tạo thành đƣợc xác định từ giản đồ phân tích nhiệt TG-DTA (Hình 3.7).
Đối với tất cả các mẫu, giai đoạn mất khối lƣợng đầu tiên, trong khoảng nhiệt độ phòng đến 200oC, là do mất nƣớc hấp phụ vật lý trong mẫu. Với mẫu HA khơng có polymaltose, sau giai đoạn mất nƣớc vật lý, khối lƣợng mẫu hầu nhƣ không đổi thể hiện bản chất bền nhiệt của HA.
Với mẫu polymaltose P3, đƣờng DTA thể hiện hai đỉnh tỏa nhiệt tại 378oC và 506oC, liên quan với sự giảm khối lƣợng khoảng 99%, tƣơng ứng với sự phân hủy nhiệt của polymaltose. Trong khi đó, với các mẫu HAP những đỉnh này quan sát đƣợc ở nhiệt độ khá thấp, trong khoảng 326°C và 375°C. Sự dịch chuyển nhiệt độ
phân hủy polymaltose sang vùng nhiệt độ thấp hơn chỉ ra sự giảm độ bền nhiệt của polymaltose khi nằm trong phức với HA. Điều này có thể liên quan với tƣơng tác giữa các phân tử HA và chuỗi polymaltose.
Hình 3.7. Giản đồ TG-DTA của mẫu HA, polymaltose P3 và các mẫu HAP
với hàm lượng polymaltose khác nhau
Hàm lƣợng polymaltose trong mẫu HAP đƣợc xác định gần đúng từ sự giảm khối lƣợng trong khoảng nhiệt độ này. Cụ thể với các mẫu HAP đã nghiên cứu, kết quả (tính cho sản phẩm khơ) đƣợc cho trong Bảng 3.1 sau đây:
Hàm lƣợng P3 ban đầu (%) Hàm lƣợng P3 thực tế trong mẫu HAP (%)
20 10.6
35 18.4
50 27.2
65 41.8
80 58.3
Bảng 3.1. Hàm lượng polymaltose thực tế trong các mẫu HAP
Vì polymaltose tan tốt trong nƣớc nên rất khó để có thể thu đƣợc toàn bộ lƣợng polymaltose đƣa vào ban đầu. Hơn nữa, thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi cho
thấy, nếu dùng hỗn hợp etanol/nƣớc tỉ lệ 1/1 thì chỉ kết tinh đƣợc khoảng 3% polymaltose từ dung dịch nƣớc với nồng độ polymaltose tƣơng ứng.
Nhƣ vậy, có thể thấy rằng HA đã hình thành trong mạng polymaltose và kéo theo polymaltose cùng kết tủa.
Giản đồ XRD của một số mẫu đại diện đƣợc đƣa trên Hình 3.8.
Hình 3.8. Giản đồ XRD các mẫu HAP với hàm lượng P3 khác nhau
Kết quả XRD cho thấy hầu nhƣ khơng có sự khác biệt về thành phần pha và đặc trƣng tinh thể HA trong tất cả các mẫu. Điều này chứng tỏ hàm lƣợng polymaltose dù rất cao cũng không ảnh hƣởng đến sự hình thành pha HA.
Dựa trên quan sát ảnh TEM (Hình 3.9) của các mẫu HAP với hàm lƣợng polymaltose P3 thay đổi.
Quan sát ảnh SEM của các mẫu ta thấy rằng bề mặt các compozit đồng đều, không phân biệt đƣợc pha tinh thể HA và pha vơ định hình polymaltose. Chứng tỏ, HA và polymaltose đã hình thành nên vật liệu compozit đồng nhất về cấu trúc. Mẫu HA các hạt bị kết tập, khơng rõ biên hạt, hạt có dạng hình hạt gạo và có kích thƣớc lớn. Ở các mẫu từ HA20 đến HA80 các hạt phân tán đều, biên hạt rõ ràng, kích thƣớc hạt nhỏ hơn so với mẫu HA.
HA20 HA25 HA30
HA35 HA50 HA65
HA80 HA
Hình 3.9. Ảnh SEM của các mẫu HAP với hàm lượng polymaltose khác nhau Như vậy, hình thái, kích thước hạt HA hầu như khơng thay đổi với hàm lượng Như vậy, hình thái, kích thước hạt HA hầu như không thay đổi với hàm lượng polymaltose thực tế nằm trong khoảng khá rộng. Tuy nhiên hàm lượng polymaltose càng cao thì lượng HA trong mẫu càng thấp dẫn đến giảm hiệu quả sử dụng của sản phẩm. Do vậy chúng tôi lựa chọn khoảng hàm lượng polymaltose 20-30%, gần với hàm lượng của pha hữu cơ trong xương tự nhiên.
3.3.2. Ảnh hƣởng của tốc độ cấp axit H3PO4
Yếu tố pH đóng vai trị rất quan trọng, ảnh hƣởng mạnh đến bản chất của các ion phosphate có thể có mặt trong dung dịch cũng nhƣ quá trình chuyển các pha trung gian thành pha HA bền.
Trong hệ CaO – P2O5 – H2O, tồn tại các hợp chất canxi phosphate khác nhau
tuỳ thuộc vào tỷ lệ của các chất ban đầu và điều kiện áp suất, nhiệt độ, độ pH… Giản đồ pha CaO – P2O5 – H2O [64] thể hiện ở vùng kiềm ứng với tỷ lệ Ca/P ≥1.67, chỉ tồn tại duy nhất pha rắn HA, hợp chất hydroxyapatite tồn tại ở pha rắn này có thành phần hố học theo đúng tỷ lệ hợp thức Ca10(PO4)6(OH)2 (Ca/P=1.67, Stoichiometric Hydroxyapatite – SHA). Từ đó thấy rằng, pH cao sẽ thúc đẩy quá trình tạo thành pha HA.
Trong phƣơng pháp tổng hợp HA đi từ Ca(OH)2 và H3PO4, bên cạnh việc đảm bảo tỉ lệ Ca(OH)2/H3PO4, thông số pH củ a dung di ̣ch cịn đƣơ ̣c kiểm soát thơng qua viê ̣c thay đổi tốc độ thêm H 3PO4. Vì H3PO4 là một axit có độ mạnh trung bình, phân ly thành 3 giai đoạn:
H3PO4 H2PO4- + H+ pKa1 = 2.2 (1) H2PO4- HPO42- + H+ pKa2 = 7.2 (2) HPO42- PO43- + H+ pKa3 = 12.3 (3)
Nếu tốc độ cấp axit quá chậm sẽ làm giảm tốc độ chung của phản ứng do tạo thành lớp sản phẩm mịn, bao bọc hạt Ca(OH)2 ngăn chặn sự tiếp xúc với axit và kéo dài nên thời gian phản ứng không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm HA tạo thành.
Tốc độ cấp axit tăng lên làm cho tốc độ phản ứng chung tăng, thuận lợi cho sự tạo mầm và hình thành các hạt có kích thƣớc nhỏ. Tuy nhiên, nếu tốc độ cấp axit quá lớn, phản ứng trung hoà giữa Ca(OH)2 và H3PO4 xảy ra chậm hơn sẽ dẫn đến hiện tƣợng quá axit cục bộ. Điều này ảnh hƣởng không tốt đến độ đơn pha của sản phẩm. Vì khi cấp axit với tốc độ lớn, pH của dung dịch sẽ giảm đột ngột, dẫn đến sự phân ly axit khơng hồn toàn, tạo ra các ion HPO42-
và H2PO4-. Điều đó có thể dẫn đến việc lẫn một phần kết tủa chứa các ion này (chẳng hạn Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-
x(OH)2-x ) trong thành phần HA tổng hợp đƣợc. Trong trƣờng hợp này, cần kéo dài
thời gian phản ứng để chuyển chúng về dạng HA. Nhƣ vậy, tốc độ cấp axit và thời gian duy trì phản ứng (già hóa) có liên quan chặt chẽ với nhau.
Trong luận văn này, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu đƣa H3PO4 vào phản ứng với các tốc độ khác nhau , từ 1ml/phút đến tốc độ khá cao là 6ml/phút và xác định pH phản ứng trong từng trƣờng hợp. Với tốc độ cấp axit khác nhau , pH của hỗn hợp sau khi thêm hết axit có thay đổi , nhƣng vẫn nằm trong khoảng trên 8 đến 10. Ở khoảng pH này, HA là sản phẩm bền nhất trong số các hợp chất canxi photphat nên sản phẩm cuối cùng của phản ứng thu đƣợc vẫn là đơn pha HA.
Ảnh SEM của mẫu tạo thành với tốc độ cấp axit 6ml/phút (Hình 3.10) cho thấy các hạt HA có kích thƣớc hạt khoảng 30-40nm và phân bố khá đồng đều. Nhƣ vậy, đối với phản ứng tạo HA khi có mặt polymaltose, có thể thấy rằng, tốc độ cấp axit có thể khá cao mà vẫn tạo thành HA đơn pha với kích thƣớc nhỏ và có độ phân tán tốt.
Như vậy, tốc độ cấp axit 6ml/phút được lựa chọn nhằm rút ngắn thời gian tổng hợp mà sản phẩm HAP thu được vẫn đảm bảo là đơn pha và các hạt HA có kích thước nhỏ, đồng đều và phân tán tốt.
3.3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng
Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở 3 nhiệt độ: 30o
C, 60oC và 90oC. Kết quả chụp XRD đƣợc thể hiện trong Hình 3.11.
Khi nhiệt độ tăng, các vạch nhiễu xạ có xu hƣớng thu hẹp và sắc nét hơn, cho thấy kích thƣớc cũng nhƣ độ tinh thể của HA tăng theo sự tăng nhiệt độ.
2D Graph 4 2 Theta - Scale 10 20 30 40 50 60 70 C p s 90oC 60oC 30oC
Hình 3.11. Giản đồ XRD của các mẫu HAP tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau
Kết quả xác định gần đúng kích thƣớc tinh thể và độ tinh thể (dựa trên vạch nhiễu xạ ứng với mặt 002) trong các mẫu HAP theo nhiệt độ trong Bảng 3.2:
Nhiệt độ tổng hợp 30oC 60oC 90oC
Kích thƣớc tinh thể (nm) 19 23 28
Độ tinh thể (Xc) 0.17 0.32 0.55
Bảng 3.2. Kích thước và độ tinh thể của mẫu HAP theo nhiệt độ
nhiệt độ tăng, kích thƣớc tinh thể HA tăng lên. Điều này cũng đƣợc khẳng định qua ảnh TEM của các mẫu HAP đã tổng hợp (Hình 3.12).
So với việc tổng hợp HA khơng có polymaltose, tuy cùng xu hƣớng tăng kích thƣớc hạt theo nhiệt độ nhƣng điểm khác biệt ở đây là, khi có mặt polymaltose hiện tƣợng kết tập giảm hẳn và sự thay đổi kích thƣớc và độ tinh thể của hạt HA theo nhiệt độ cũng giảm.
30o C 60oC 90oC
Hình 3.12. Ảnh TEM của các mẫu HAP tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau
ở thang đo 100nm, độ phóng đại 60000x
Theo nghiên cứu trƣớc đây của chúng tôi [32], khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 30oC lên 60oC, kích thƣớc hạt HA khơng có polymaltose tăng khoảng 50%. Cịn với sự có mặt của polymaltose.
Từ ảnh TEM, có thể thấy trong HAP, chỉ khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 30- 90oC, các hạt HA mới kết tập rõ rệt thành dạng que, nhƣng khá mảnh, chiều dài tăng khoảng 50% so với hạt tạo thành ở 30oC. Có thể giải thích điều này là do trong HAP, các tinh thể HA đƣợc bao bọc trong cấu trúc chuỗi xoắn kép của phân tử polymaltose, làm hạn chế sự phát triển tinh thể và hiện tƣợng kết tập khi nhiệt độ tăng. Kết quả này cũng phù hợp với dữ liệu XRD ở trên. Với xu hƣớng tăng kích thƣớc hạt theo nhiệt độ, lƣ̣a cho ̣n thƣ̣c hiê ̣n phản ƣ́ng ở nhiê ̣t đô ̣ 30oC là phù hợp với mong muốn ta ̣o thành sản phẩm với kích thƣớc ha ̣t nhỏ.
Từ các kết quả trên ta thấy rằng tổng hợp HAP ở nhiệt độ phịng là thích hợp nhất.
3.3.4. Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng
Thời gian phản ứng (thời gian già hóa) cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến chất lƣợng sản phẩm đặc biệt khi phản ứng ở nhiệt độ thấp. Kéo dài thời gian già hóa làm cho sản phẩm có thành phần tỉ lƣợng và độ kết tinh tốt hơn. Nhƣ đã trình bày ở trên, một số dạng canxi phosphate khác nhƣ OCP (octacalcium phosphate), DCPD (dicalcium phosphate dihydrate), TCP (tricanxi phosphate)… cũng có thể hình thành đồng thời trong quá trình phản ứng. Các pha này không bền dần dần sẽ chuyển thành HA bền hơn về nhiệt động học và có tích số tan nhỏ hơn rất nhiều.
Từ đó có thể thấy rằng, tuy phản ứng kết tủa tạo thành HA xảy ra nhanh nhƣng rất cần thời gian khuấy và duy trì sau đó (thời gian già hóa) để chuyển hố hoàn toàn các pha canxi phosphat khác thành HA, đảm bảo sản phẩm phản ứng là HA đơn pha.
Thực hiện thí nghiệm với thời gian già hóa thay đổi từ 3h, 6h đến 8h với qui mô 10g sản phẩm . Một phần mẫu đƣợc lấy ra sau các khoảng thời gian tƣơng ứng và đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp XRD.
Giản đồ XRD của các mẫu đƣợc đƣa trên Hình 3.13.
Với mẫu già hóa 3h, trên giản đồ vẫn xuất hiện pha Ca(OH)2 và pha DCPD - CaHPO4.(H2O)2, cho thấy rằng phản ứng vẫn chƣa hoàn tồn. Các mẫu cịn lại đều