Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. Một số phƣơng pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen
Sự biểu hiện của gen có thể đƣợc đánh giá ở mức độ RNA. Nồng độ mRNA của một gen ở các giống lúa khác nhau có thể khác nhau trong cùng một điều kiện sinh trƣởng. Từ đó góp phần đánh giá đƣợc mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình ở các giống lúa khác nhau.
1.4.1. Lai northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ
Northern blot là một phƣơng pháp thí nghiệm đƣợc sử dụng để phát hiện và định lƣợng các phân tử RNA cụ thể trong một hỗn hợp các RNA. Phƣơng pháp này có thể sử dụng để phân tích một mẫu RNA từ một mơ hoặc loại tế bào cụ thể để đo lƣờng sự biểu hiện của các gen đặc hiệu.
Bƣớc đầu tiên trong một phản ứng northern blot là làm biến tính RNA trong mẫu thành các sợi đơn. Các phân tử RNA này sau đó đƣợc phân tách theo kích thƣớc của chúng bằng cách sử dụng phƣơng pháp điện di. Sau đó, tất cả các băng RNA ban đầu trên gel đƣợc chuyển vào một màng thấm. Tiếp theo, các màng đƣợc lai với các mẫu đầu dị đã đƣợc thiết kế sẵn, có trình tự bổ sung với một chuỗi RNA đặc biệt trong mẫu (đầu dị có thể là DNA hoặc RNA). Bƣớc lai này cho phép thăm dò / gắn kết, với một đoạn RNA cụ thể trên màng. Các đầu dò đã đƣợc gắn nhãn phóng xạ hoặc chất nhuộm huỳnh quang sẽ cho phép xác định kích thƣớc dựa vào vị trí của phân tử RNA quan tâm gắn trên màng và ƣớc tính nồng độ dựa vào cƣờng độ tín hiệu của mẫu dò. Tuy nhiên, phƣơng pháp này tồn tại một số nhƣợc điểm: kỹ thuật thực hiện trong thời gian dài, yêu cầu lƣợng RNA lớn để phân tích nên khơng chính xác khi phân tích lƣợng RNA nhỏ [1; 42].
1.4.2. RT-PCR và Real time PCR
RT-PCR và Real time PCR là hai phƣơng pháp chuẩn đƣợc sử dụng cho việc phân tích định lƣợng RNA. Ƣu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, đặc hiệu và độ nhạy cao (thời gian thực hiện ngắn, có thể phân tích với lƣợng mẫu nhỏ) cung cấp thơng tin tin cậy về định tính và định lƣợng [9].
RT-PCR đƣợc sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen thơng qua q trình tổng hợp cDNA từ RNA sử dụng enzym phiên mã ngƣợc. Các cDNA sau đó đƣợc sử dụng nhƣ là khuôn mẫu cho phản ứng PCR. Định lƣợng bằng kỹ thuật RT-PCR có thể đƣợc thực hiện theo 2 cách gồm phản ứng một bƣớc hay phản ứng hai bƣớc [88]. Ở phản ứng một bƣớc, quá trình tổng hợp cDNA và PCR đƣợc thực hiện chỉ trong 1 ống phản ứng. Trong khi phản ứng hai bƣớc đòi hỏi hai quá trình này đƣợc thực hiện trong hai ống phản ứng riêng biệt. Phản ứng một bƣớc đƣợc cho là môi trƣờng thực nghiệm đồng nhất hơn và giảm thiểu đƣợc sự nhiễm mẫu. Tuy nhiên mẫu mRNA ban đầu rất dễ bị suy thoái trong q trình lặp lại thí nghiệm, dẫn đến kết quả ít chính xác hơn phản ứng hai bƣớc. Định lƣợng sản phẩm RT-PCR có thể đƣợc phát hiện bằng cách phân tích điểm cuối PCR (end - poin) (bằng cách chạy điện di DNA trên gel agarose sau khi phản ứng kết thúc) hoặc phƣơng pháp real-time PCR (cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đánh dấu huỳnh quang, hàm lƣợng DNA tổng hợp đƣợc sẽ tƣơng ứng với tín hiệu huỳnh quang). Real-time PCR có ƣu điểm so với RT-PCR là cho phép định lƣợng số bản copy với độ chính xác và độ nhạy cao. Thời gian thí nghiệm đƣợc rút ngắn, ít thao tác thí nghiệm hơn nên tránh đƣợc nhiễm mẫu. Đây có thể coi là tiêu chuẩn vàng trong các phân tích định lƣợng.
1.4.3. Microarray
Microarray (gene chip, genome chip hay DNA chip) là một phƣơng pháp dựa trên nguyên tắc lai giữa DNA - DNA hay DNA - RNA. Trong đó các đoạn đầu dị DNA đã đánh dấu đƣợc gắn trên bề mặt rắn bằng các liên kết hóa học. Các trình tự DNA và RNA đƣợc cho chạy qua giá thể rắn sẽ bắt cặp bổ xung với các đầu dị. Từ đó, vị trí chính xác và trình tự của gen đƣợc xác định và đƣợc ghi lại trên một cơ sở dữ liệu. Phƣơng pháp này có thể đƣợc sử dụng để đánh giá định tính và định lƣợng sự biểu hiện của hàng ngàn gen, trong một thí nghiệm đơn giản và rất hiệu quả. Tuy nhiên, phƣơng p háp này địi hỏi giá thành cao, quy mơ phân tích lớn.
1.5. Tình hình nghiên cứu họ gen HKT ở lúa
Hiện nay, hƣớng nghiên cứu về các họ gen chịu mặn, đặc biệt là họ HKT
đang rất đƣợc quan tâm. Ví dụ, trên thế giới, các nghiên cứu về gen OsHKT1;5 của
các tác giả Lin [49], Olivier Cotsaftis [61] đã cho thấy vai trò trung tâm trong việc thu thập các ion Na+ từ dòng xylem vào các mơ bao quanh bó mạch ở rễ. Nghiên cứu của Kader ở các gen OsHKT2;1; OsHKT2;2 cho thấy mức độ biểu hiện khác
nhau ở các điều kiện stress mặn giữa 2 giống lúa nhiễm mặn và kháng mặn [43]… Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu về một số gen nhƣ phân tích đa hình trình tự gen
OsHKT1;1 [94]…; phân tích biểu hiện của gen OsHKT2;1 ở các điều kiện xử lý
mặn khác nhau [95].
Gen OsHKT1;4 cũng đóng vai trị quan trọng trong quá trình đáp ứng stress mặn ở lúa. Nghiên cứu phân tích đa hình một vùng trình tự 522 bp của sản phẩm phiên mã từ gen này ở hai giống Pokkali và Nipponbare (vùng này chứa 2 vị trí nối giữa exon 1 - exon 2 và exon 2 - exon 3) cho thấy xuất hiện hai dạng biến đổi có kích thƣớc dài hơn 104 bp và 186 bp so với dạng cơ sở. Nguyên nhân là do sai khác trong quá trình cắt nối luân phiên giữa exon 2 và exon 3, dẫn đến xuất hiện bộ ba kết thúc sớm (nằm trong vùng intron 2) ở 2 dạng biến đổi này, và khơng có chức năng (Hình 1.8) [61]. Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện đƣợc một vị trí đa hình axit amin giữa 2 giống Nipponbare và Pokkali, và không ảnh hƣởng đến chức năng của gen OsHKT1;4 [61]. Phân tích biểu hiện của gen OsHKT1;4 đƣợc thực hiện
giữa rễ - thân bẹ cho thấy gen biểu hiện mạnh hơn ở thân bẹ, và biểu hiện mạnh hơn ở lá non khi phân tích biểu hiện ở lá non- lá già [61]. Tuy nhiên, hiện vẫn chƣa có
phân tích nào về trình tự promoter của gen OsHKT1;4. Cũng nhƣ chƣa có nghiên
cứu nào về gen OsHKT1;4 ở nƣớc ta. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tơi thực hiện phân tích đa hình trình tự vùng promoter, đa hình vùng mã hóa của gen
OsHKT1;4 ở 12 giống lúa (trong đó có 10 giống lúa địa phƣơng). Đồng thời bƣớc
đầu đánh giá mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở 2 giống lúa Nipponbare và
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu
Vật liệu thí nghiệm gồm hạt giống của 12 giống lúa đƣợc cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp và Học viện Nông nghiệp Việt nam. Trong đó 12 giống lúa sử dụng trong phân tích đa hình và 2 giống lúa đƣợc sử dụng trong phân tích biểu hiện (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu STT Tên giống lúa STT Tên giống lúa
1 Nƣớc mặn dạng 1 2 Chiêm rong 3 Cƣờm dạng 1 4 Nƣớc mặn dạng 2 5 Nipponbare 6 Cƣờm dạng 2 7 Chăm biển 8 Nếp cúc 9 Chăm 10 Tép lai 11 Pokkali 12 Chiêm đen 2.1.2. Hóa chất
- Các hóa chất đƣợc cung cấp bởi hãng Thermo Scientific:
Kit tách chiết ARN tổng số (GeneJET Plant RNA Purification
Mini Kit); kit tổng hợp cDNA (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit); kit tinh sạch (GeneJET PCR Purification Kit)
Dream Taq polymerase, Dream Taq buffer 10X, dNTPs
Enzym DNAse I
Thang chuẩn 1kb, 100bp
Mồi sử dụng cho phản ứng PCR
- Dung dịch thủy canh của Yoshida (phụ lục 1)
- Ngồi ra cịn có một số hóa chất khác đƣợc sử dụng trong tách chiết DNA, điện di nhƣ: đệm CTAB, Tris-HCL, EDTA, Chloroform, isomylalcohol, NaCl, đệm TE. agarose, ethidium bromide… đều đạt tiêu chuẩn của phịng thí nghiệm sinh học phân tử.
Bảng 2.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR
STT Tên mồi
Trình tự mồi
Mồi xi (5’→3’) Mồi ngƣợc (5’→3’) Mồi sử dụng trong phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4
1 Pro-HKT1;4 CAGCTGATCGGATGG TTGAG
GAGCAACAAAATAGGC CACGC
Mồi sử dụng trong phân tích đa hình vùng mã hóa của gen OsHKT1;4
2 HKT1;4-2 (exon 2) CCCAAGGGTGACTTTC TGATCG GTATCAGTTTGCCAGA GTCGC 3 HKT1;4-3 (exon 3) TCACAACTCTCCTACC TGACC GAGCTTTGTGCAAGGA TGACAG
Mồi sử dụng trong phân tích RT-PCR
4 ACT [93] CTGATGGACAGGTTAT CACC CAGGTAGCAATAGGTA TTACAG 5 RT-HKT1;4 CGACGTGGTTCCCATT TGAAG ATATGCACTGACAACTT CGACA
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phịng thí nghiệm Di truyền, Bộ mơn Di truyền học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội: Bể ổn nhiệt; máy ly tâm Mikro 22R Hettich; máy PCR 9700 / Kyratex; bể điện di Bio rad…
2.2. Nhóm phƣơng pháp sử dụng trong phân tích đa hình gen 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Cây lúa trồng trong đất khoảng 2 - 3 tuần thì tiến hành thu mẫu lá. Mẫu lá lúa đƣợc nghiền bằng máy nghiền mẫu Mixer mill (Retsch, CHLB Đức), trong nitơ lỏng. DNA tổng số (gDNA) từ mẫu lá lúa đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp CTAB: Cân 50mg mẫu lá đã nghiền trong ống eppendorf (epp) và bổ sung thêm 500
µl đệm CTAB, votex đều hỗn hợp. Sau đó ủ mẫu ở 65oC trong khoảng 15 phút. Ống
mẫu đƣợc lấy ra để nguội về nhiệt độ phòng, rồi bổ sung 500 µl Chloroform /
isoamylacohol (tỷ lệ 24 : 1), votex. Ly tâm ống ở 10 000 vòng / phút, 10 phút, 4oC.
Thu dung dịch bên trên (pha trong) và chuyển sang ống epp mới. Bổ sung 300 µl isopropanol vào mỗi ống và để ở nhiệt độ lạnh khoảng 10 phút. Ly tâm ống 14 000 vòng / phút, 5 phút, 4oC. Đổ bỏ pha trên, thu DNA tủa trắng dƣới đáy ống và rửa tủa
bằng 500 µl EtOH 70 %. Ly tâm thu lại tủa ở 14 000 vòng / phút, 5 phút, 4oC. Để
tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút trong khoảng 60 phút, sau đó hịa tan tủa DNA trong đệm TE và bảo quản ở - 20oC.
DNA sau khi tách chiết đƣợc kiểm tra nồng độ và chất lƣợng bằng cách điện di trên gel agarose 1 % và đo tỷ lệ OD bằng máy Nanodrop Spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Mỹ).
2.2.2. PCR khuếch đại vùng gen
Thành phần phản ứng và quy trình nhiệt của phản ứng PCR đƣợc trình bày ở
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng
PCR khuếch đại gen
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
khuếch đại gen
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) dd H2O 35.2 10 ng/µl DNA khn 1.5 10X Taq buffer (+ Mg2+) 5 2mM dNTPs 5 10µM Mồi xi 1.5 10µM Mồi ngƣợc 1.5 5u/µl Taq polymerase 0.3 Tổng thể tích phản ứng 50 µl Bƣớc chạy Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ Biến tính bƣớc đầu 94 5’ 1 Biến tính 94 30s 35 Gắn mồi Tm 30s
Kéo dài chuỗi 72 1’ - 2’
Kéo dài bổ sung 72 7’ 1
Bảo quản 16 ∞
Nhiệt độ gắn mồi (Tm) đƣợc tối ƣu hóa cho phản ứng PCR với mỗi cặp mồi
2.2.3. Điện di trên gel agarose
3µl mỗi mẫu (gDNA / RNA tổng số / Sản phẩm PCR khuếch đại gen) đƣợc mix đều với 2µl dye 1X (có chứa ethidiumbromide) và đƣợc tra vào các giếng trên gel agarose 1 %. Quá trình điện di đƣợc chạy ở 90 V trong khoảng 25 - 30 phút. Sử dụng agarose 2 %, chạy ở 90 V trong 35 - 40 phút để kiểm tra kích thƣớc và nồng độ tƣơng đối với sản phẩm phản ứng RT-PCR. Kích thƣớc tƣơng đối của sản phẩm sẽ đƣợc so sánh với thang chuẩn 1 Kb và 100 bp.
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng kit GeneJET PCR Purification (Thermo Scientific) và thực hiện theo nhƣ hƣớng dẫn của nhà sản xuất. DNA đã tinh sạch sẽ đƣợc giải trình tự bởi cơng ty 1st Base, Singapore sử dụng máy giải trình tự ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).
2.2.5. Phân tích số liệu
Cặp mồi đặc hiệu dùng cho phản ứng PCR để nhân bản gen đƣợc thiết kế sử dụng phần mềm Primer-Blast trên NCBI. Kết quả giải trình tự đƣợc phân tích sử dụng phần mềm Chromas. Các trình tự nucleotide đƣợc so sánh sử dụng công cụ Multiple sequence alignment. Các phân tích yếu tố cis đƣợc thực hiện bằng cơng cụ PLACE / Signal Scan.
2.3. Nhóm phƣơng pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 2.3.1. Trồng lúa trong dung dịch thủy canh và xử lý mặn 2.3.1. Trồng lúa trong dung dịch thủy canh và xử lý mặn
Hạt giống đƣợc ngâm ủ trong tối trong 48 giờ. Sau đó hạt lúa đã nảy mầm đƣợc chuyển sang 3 khay chia ô có đan lƣới và đƣợc đặt trong 3 hộp khác nhau chứa dung dịch dinh dƣỡng Yoshida (thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở phụ lục 1); pH của dung dịch dinh dƣỡng đƣợc duy trì trong khoảng pH 5.0 - 5.5 và đƣợc thay mới hàng tuần, trong 2 tuần. Ba nhóm mẫu đƣợc đánh dấu: nhóm cây đối chứng (khơng xử lý mặn); nhóm cây bị xử lý mặn ở nồng độ 50 mM và nhóm cây bị xử lý mặn ở nồng độ 100 mM. Sau 14 ngày trồng trong dung dịch dinh dƣỡng, thí nghiệm xử lý mặn đƣợc tiến hành ở 2 nhóm cây bị xử lý mặn bằng cách bổ sung NaCl vào dung dịch dinh dƣỡng để đạt nồng độ tƣơng ứng là 50 mM và 100 mM. Nhóm đối chứng khơng bổ sung NaCl vào dung dịch dinh dƣỡng. Mô lá đƣợc thu thập ở cả 3 nhóm mẫu tại thời điểm 24h, 48h và 72h sau khi xử lý mặn. Các mẫu thu đƣợc tại mỗi thời điểm sẽ đƣợc nghiền ngay trong nitơ lỏng bằng máy nghiền
mẫu Mixer mill (Retsch, CHLB Đức) và đƣợc lƣu trữ ở - 80oC để sử dụng làm vật
liệu cho phân tích biểu hiện gen.
2.3.2. Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số đƣợc tách chiết sử dụng kit GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific) và đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Mô lá đã đƣợc nghiền thành dạng bột mịn sẽ đƣợc trộn đều với đệm lysis có chứa guanidinium thiocyanate. Ly tâm, thu pha trong chuyển sang ống epp mới và
bổ sung cồn tuyệt đối. Hỗn hợp này sau đó đƣợc chuyển đến cột lọc chứa màng gel silica có ái lực với acid nucleotide và đƣợc rửa với các Wash Buffers. Thu RNA bằng cách hịa tan và giải phóng RNA khỏi cột lọc bằng nuclease - free. RNA sẽ lƣu trữ ở - 80oC.
2.3.3. Xử lý với DNase I
RNA tổng số sau khi tách chiết đƣợc xử lý với DNase I để loại bỏ gDNA. Các bƣớc thực hiện gồm: Bổ sung 1µl DNase I (1U/1µl) + 1µl đệm 10X vào 20µl
RNA tổng số và ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đó thêm 1µl EDTA 50 mM và ủ ở
70oC trong 15 phút để ức chế hoạt động của DNase I.
2.3.4. Tổng hợp cDNA
cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA đã xử lý DNase I, sử dụng kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Các bƣớc thực hiện theo nhƣ bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích (µl) Quy trình
RNA tổng số 2 Ủ ở 65o
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh nhanh trên đá tối thiểu 1 phút.
Mồi oligodT 1 H2O 9 5X Reaction Buffer 4 Hỗn hợp có thể tích 20 µl sau đó sẽ đƣợc chạy ở 42oC trong 60 phút và tiếp theo là 70oC trong 5 phút
RiboLock Rnase
Inhibitor (20 U/µl) 1
10 mM dNTPs 2
Revert Aid M-MuLV
RT (200 U/µl) 1
Tổng thể tích 20 µl
2.3.5. RT-PCR
cDNA sau đó đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với mồi RT- HKT1;4 và mồi ACT .Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với mỗi mồi đƣợc trình bày nhƣ bảng 2.6 và 2.7
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng RT-PCR RT-PCR Bảng 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) HKT1;4 Actin dd H2O 10.18 10.18 10 ng/µl cDNA 1 1 10X Taq buffer (+ Mg2+) 1.5 1.5 2mM dNTPs 1.2 1.2 10µM Mồi xi RT-HKT1;4 / ACT 0.5 0.5 10µM Mồi ngƣợc RT-HKT1;4 / ACT 0.5 0.5 5u/µl Taq polymerase 0.12 0.12 Tổng thể tích phản ứng 15 µl Bƣớc chạy Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ Biến tính