2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Cây Bạch tật lê (thân, quả, rễ) khô đƣợc lấy từ vùng trồng Bạch tật lê theo tiêu chuẩn VietGAP của Viện Ứng dụng Công nghệ tại Ninh Thuận. Cây đƣợc thu vào tháng 9, khi quả ngả sang màu hơi vàng.
Hình 2.1. Mẫu cây Bạch tật lê đƣợc phơi khơ và mẫu đã khơ
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
- Dung môi kỹ thuật: Methanol, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n- hexane (Hàn Quốc, Indonesia), cồn thực phẩm, nƣớc cất 1 lần.
- Dung mơi phân tích HPLC: methanol, acetonitrile, nƣớc tinh khiết HPLC (Fisher)
- Bột sắc ký silica gel pha thƣờng, pha đảo C-18, sephadex LH-20, dianion HP20
- Bình chiết thuỷ tinh 10, 5, 2, 1 lít - Cột sắc ký thuỷ tinh
- Bình cầu thuỷ tinh cất quay. - Bình định mức loại 25mL. - Máy xay mẫu
- Máy cất quay chân không - Bể siêu âm
- Bộ lọc busne, máy bơm hút chân không. - Phễu chiết phân lớp
- Chất chuẩn Protodioscin 98% (TRC, Canada).
- Máy LC-MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems. - Cột sắc ký HPLC: Cột VertiSep GES C18 (150x4,6 mm; 5μm) và cột bảo vệ GES C18 của hãng Vertical.
- Máy siêu âm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch tật lê
Để lựa chọn dung môi chiết phù hợp nhất, mẫu Bạch tật lê (2 kg) đƣợc xay thành bột mịn và ngâm chiết với các dung môi khác nhau methanol, ethanol 95%, 50% và nƣớc. Chiết mẫu bằng cách ngâm chiết ở điều kiện thƣờng, đun hồi lƣu trong 2 giờ và ngâm chiết kết hợp siêu âm với thời gian ngâm chiết khác nhau. Sau đó hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc và máy cô quay để thu cặn ethanol, methanol, nƣớc khô. Mẫu đƣợc chiết lần lƣợt 4 lần. Dịch chiết của các lần chiết đƣợc cất loại dung môi để cân so sánh khối lƣợng cao chiết thu đƣợc. Ký hiệu là cao chiết A.
2.2.2. Phương pháp lựa chọn phương pháp chiết (kiểu chiết), nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch tật lê
Từ lƣợng Bạch tật lê tổng số ban đầu (2kg) đƣợc chiết bằng các phƣơng pháp đun hồi lƣu (~95ºC trong 2h), ngâm cách thuỷ 80ºC trong 2h, siêu âm (40ºC trong 0,5 giờ) và ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng trong 24h). Thu lấy cao chiết tiến hành cân khối lƣợng và so sánh hiệu suất của từng phƣơng pháp.
Với phƣơng pháp đã đƣợc lựa chọn, thời gian chiết và nhiệt độ chiết đƣợc tối ƣu bằng cách chiết trong các nhiệt độ (95ºC, 80o
C và 60oC) và thời gian (2h, 3h và 4h). Cân và so sánh lƣợng cao chiết thu đƣợc để tìm ra điều kiện tối ƣu cho phƣơng pháp chiết.
2.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch tật lê
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết tổng và thu đƣợc cao chiết tổng, cao chiết này đƣợc chiết phân đoạn bằng các dung mơi có độ phân cực khác nhau để
loại bỏ các thành phần hố học khơng mong muốn, làm giàu thành phần protodioscin. Cao chiết A đƣợc hồ lại vào 3 lít nƣớc sau đó chiết bằng dung mơi ethyl acetate (1lít x 3lần). Tách loại lớp dung mơi hữu cơ, dịch nƣớc đƣợc cô quay cịn 2L để loại bỏ dung mơi hữu cơ tồn dƣ thu đƣợc dịch B.
2.2.4. Phương pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin
Lọc dịch B còn lại qua cột diaion HP20. Rửa giải bằng các hệ dung môi nƣớc, dung môi cồn 80%. Gom dịch rửa giải cồn 80% và cất loại dung môi thu đƣợc cao C.
Tách phân đoạn cao chiết C thu đƣợc trên cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel pha thƣờng, tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ = 1/5 theo khối lƣợng, cột nhồi 10cm) và dung môi rửa giải lần lƣợt là ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol 50:1, ethyl acetate:ethanol 10:1 và ethanol 95%. Dịch rửa giải từ hệ ethyl acetate:ethanol 10:1 đƣợc gom lại, cất loại hết dung môi đến khô thu đƣợc cao D.
Hàm lƣợng protodioscin trong cao chiết D thu đƣợc đƣợc kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Điều kiện phân tích HPLC: Máy sắc ký Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems. Cột sắc ký: Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent. Pha động gradient 2% acetonitrile trong nƣớc trong 20 phút với tốc độ dòng: 0.5 ml/phút. Thể tích bơm mẫu 5μl, nhiệt độ cột 30ºC. Đầu dị DAD bƣớc sóng phân tích 210 nm.
2.2.5. Phương pháp dựng đường chuẩn định lượng protodioscin
Đƣờng chuẩn định lƣợng có dạng y = ax + b đƣợc xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích pic UV đƣợc chọn (y) và nồng độ tƣơng ứng của chất chuẩn (x). Đƣờng chuẩn định lƣợng thu đƣợc đạt độ tuyến tính cao với hệ số tƣơng quan R2
≥ 0,999 đối với phƣơng pháp định lƣợng bằng DAD.
Chất chuẩn Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn định lƣợng chất chuẩn protodioscin
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột
40 chuột nhắt trắng đực trƣởng thành đƣợc chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm: nhóm I là nhóm chứng (10 chuột); nhóm II, III, nhóm IV là nhóm đƣợc sử dụng tinh chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê với liều lần lƣợt là 2,5mg/kg (10 chuột); 5,0mg/kg (10 chuột) và 10 mg/kg (10 chuột) cân nặng.
Điều trị bằng sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê cho chuột nhóm II, III, IV: cho sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê 1 lần/ngày với liều lƣợng lần lƣợt là 2,5 mg/kg; 5,0mg/kg và 10 mg/kg cân nặng trong 4 tuần.
Một ngày sau khi sử dụng liều cuối cùng thì chuột đƣợc lấy máu định lƣợng nồng độ các hormon testosterone, gonadotropin (FSH và LH). Xét nghiệm định lƣợng nồng độ hormon testosterone, gonadotropin (FSH, LH) bằng phƣơng pháp elisa sử dụng qui trình xét nghiệm và máy xét nghiệm QTXN.MD.002/003/007 V 1,0 Cobas6000 tại bệnh viện phụ sản Trung ƣơng. So sánh nồng độ hormon sinh dục ở nhóm chứng và nhóm điều trị.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các dữ liệu đƣợc phân tích bằng phần mềm Microsoft excel và phần mềm STATA, kiểm định giá trị trung bình. Xác định hàm lƣợng và các tính chất lý hóa của sản phẩm, tiến hành lặp lại 3 lần.