1.2.2.2. Các tác dụng khác của protodioscin
Protodioscin cảm ứng apotosis ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư
Hibasami và cộng sự (2003) đã nghiên cứu tác động của protodiocin trên 2 dòng tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy HL-60 và dòng tế bào ung thƣ dạ dày KATO III.
Kết quả cho thấy tế bào HL-60 và tế bào KATO III bị ức chế khi nồng độ protodioscin tăng. Sự phát triển của tế bào HL-60 đã bị ức chế hoàn toàn khi sử dụng nồng độ 7,5 µM protodioscin. Mặt khác, protodioscin ức chế yếu sự phát triển của các tế bào KATO III. Sự ức chế tăng trƣởng đáng kể của protodioscin đã gợi ý việc kích thích apoptosis. Về mặt hình thái học, sự phân mảnh của hệ gen DNA là đặc trƣng của apoptosis. Hình thái học của tế bào HL-60 cho thấy có apoptosis sau
3 ngày điều trị với 5,0 và 10µM protodioscin nhƣng khơng quan sát thấy apotosis ở dòng tế bào KATO III. Sử dụng phƣơng pháp đếm dòng chảy tế bào cho thấy, HL- 60 đƣợc xử lí với 2,5; 5,0 và 10µM protodioscin trong 3 ngày xuất hiện apoptosis 75,2; 96,3 và 100% tƣơng ứng [26].
Trong một nghiên cứu khác, Oyama và cộng sự (2017) đã tách chiết protodioscin từ lồi Dioscorea tokoro ở Đơng bắc Nhật Bản và nghiên cứu sự ức
chế của hợp chất này lên sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy Hl-60. Kết quả cho thấy protodioscin ức chế sinh trƣởng của tế bào HL-60 với IC50 là 5,1µM [42].
Những kết quả này này chứng minh rằng protodioscin có thể kích hoạt hoạt động chống ung thƣ bằng cách kích hoạt apoptosis ở tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy ngƣời HL-60.
Protodioscin trong chữa trị bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đƣờng là một trong những vấn đề sức khoẻ đƣợc quan tâm trên toàn thế giới. Guo và cộng sự (2016) đã điều tra tiềm năng hạ đƣờng huyết và hạ lipid máu của protodioscin trên chuột bị tiểu đƣờng.
Sau 4 tuần cho ăn một chế độ nhiều chất béo, chuột đƣợc tiêm streptozotocin vào tĩnh mạch để gây bệnh tiểu đƣờng. Chuột bị bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành 5 nhóm để nhận carboxymethyl cellulose sodium, metformin (200 mg/kg), và 3 nồng độ protodioscin (10, 20 và 40 mg/kg) liên tục trong 12 tuần. Nồng độ glucose máu, glycogen, cholesterol tổng số (TC), triglycerides (TG), axit béo khơng este hóa (NEFA) cholesterol giàu lipoprotein (HDL-c), cholesterol hàm lƣợng lipoprotein thấp (LDL-c), hemoglobin đƣợc glycosyl hóa (GHb), insulin và adiponectin đƣợc tính tốn. Các kết quả cho thấy protodioscin làm tăng khả năng dung nạp glucose, làm giảm nồng độ glucose, GHb, TG, TC, LDL-c và NEFA trong khi đó tăng HDL- c, adiponectin và glycogen. Xét nghiệm mô học cho thấy protodioscin cải thiện rối loạn cấu trúc gan, làm giảm glucose máu và lipid máu ở chuột bị bệnh tiểu đƣờng. Do đó, protodioscin đƣợc xem nhƣ là một tiềm năng làm thuốc cho bệnh tiểu đƣờng [25].
Protodioscin chống viêm và oxy hóa.
Protodioscin và methyl protodioscin có tác dụng chống viêm đã đƣợc báo cáo trong nhiều nghiên cứu trƣớc đây. Liu và cộng sự (2017) đã điều tra các ảnh hƣởng của protodioscin lên bệnh viêm khớp ở chuột.
Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành các nhóm và đƣợc tiêm với các nồng độ protodioscin khác nhau (50, 100 và 200 mg/kg trọng lƣợng cơ thể). Nghiên cứu mô học, sự thay đổi các thơng số sinh hóa và sự biểu hiện cytokine viêm để đánh giá hiệu quả chống viêm của protodioscin. Kết quả cho thấy, sau 15 ngày điều trị bằng 200mg protodioscin khối lƣợng của chân sau chuột đã giảm xuống trong khi trọng lƣợng cơ thể tăng lên so với nhóm đối chứng đồng thời giảm sƣng viêm mắt cá chân và giảm sự xâm nhiễm bạch cầu phụ thuộc vào liều lƣợng protodioscin sử dụng. Ngoài ra khi sử dụng protodioscin ở nồng độ 200mg cho thấy sự hoạt động mạnh của các enzyme chống oxy hóa bao gồm: Catalase, Glutathione, Superoxide dismutase và giảm các cytokine tiền viêm. Do đó, protodioscin có tác dụng chống viêm, giảm xâm nhiễm bạch cầu và giảm các stress oxy hóa thơng qua cơ chế cải thiện các enzym liên quan đến oxy hóa và các cytokine tiền viêm [35].
Protodioscin giảm lipid máu
Các rối loạn liên quan đến chuyển hố, bao gồm chứng béo phì và tăng lipid máu là vấn đề quan trọng đối với sức khoẻ con ngƣời. Wang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu tác động của protodioscin tách chiết từ thân và rễ của loài Dioscorea nipponica (Rhizoma Dio-scoreae Nipponicae) lên chứng tăng lipid máu.
Chuột bị chứng tăng lipid máu sau khi đƣợc điều trị với protodioscin cho thấy tăng thời gian đông máu đồng thời giảm nồng độ tryglyceride, cholesterol, lipoprotein trong máu và làm tăng tỷ lệ cholesterol giàu lipoprotein (HLD) / cholesteron chứa hàm lƣợng lipoprotein thấp (LDL). Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng của protodioscin trong việc giảm lipid máu cũng nhƣ giảm cholesteron trong việc bảo vệ tim mạch [52].
1.2.2.3. Ứng dụng của protodioscin trong làm thuốc cải thiện sinh lí.
Protodioscin đã đƣợc chứng minh tác dụng dƣợc lí nổi bật nhất là tăng cƣờng chức năng tình dục. Do đó đƣợc ứng dụng trong việc sản xuất các loại thuốc tăng cƣờng sinh lí nam giới. Trên thế giới đã có những loại thuốc sử dụng dịch chiết Bạch tật lê với thành phần chính là protodioscin nhƣ Libilov™ dạng viên nén 250mg hoặc nhƣ Tribulus M1445 của Mediherb dạng viên nén có chứa 100mg protodioscin hoặc 4x Sports Food Tribulus Terrestris chứa 95% Saponins, 80% Protodioscin dạng viên 1000mg. Các loại thuốc này đều làm tăng cƣờng phát triển cơ bắp, tăng hồng cầu, vận chuyển oxy trong máu, tăng hoocmon nam giới (LH, testosteron, FSH) do đó mà cải thiện chức năng tình dục.
1.3. Các phƣơng pháp tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật
1.3.1. Các phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật
Có 4 phƣơng pháp tiền tách chiết các hợp chất từ thực vật: Sấy khơ bằng khí, sấy bằng lị vi sóng, sấy khơ và sấy đơng khơ (Bảng 1.1) [13].
Bảng 1.1. So sánh các phƣơng pháp tiền tách chiết [13] Phƣơng pháp Sấy bằng khí Sấy bằng lị vi sóng Sấy khơ Sấy đơng khơ Cách sử dụng Sử dụng bức xạ điện từ Sử dụng năng lƣợng nhiệt Dựa vào hiện tƣợng thăng hoa
Thời gian 3-7 ngày, vài tháng
cho đến một năm Ngắn hơn sấy bằng khí Ngắn hơn sấy bằng khí Qua đêm (12h)
Đặc điểm Khơng sử dụng nhiệt độ cao làm nóng đồng Có hiện tƣợng
thời
Ƣu điểm Các hợp chất chịu
nhiệt đƣợc bảo toàn. Hàm lƣợng
cao hơn
Hạn chế
Thời gian tiến hành lâu
Mẫu có thể bị nhiễm bẩn ở điều kiện nhiệt độ không ổn định
Đôi khi gây ra sự giảm thiểu lƣợng phytochemicals Đôi khi khơng có ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt động chống oxi hố Mẫu bị mất do tỏa ra trong bình đơng. Tốn kém
Có nhiều phƣơng pháp tách chiết kể cả phƣơng pháp truyền thống và hiện đại với mục đích là tách đƣợc hợp chất mong muốn. Các phƣơng pháp tách chiết truyền thống bao gồm: Ngâm, truyền, thấm và sắc; Chiết bằng máy chiết Soxhlet (Bảng 1.2). Các phƣơng pháp tách chiết hiện đại bao gồm: Chiết bằng lị vi sóng (MAE), chiết bằng sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung mơi (ASE) và chiết siêu tới hạn (SFE) (Bảng 1.3). ASE và SFE đƣợc sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả thấp. Mỗi phƣơng pháp phù hợp với mẫu chiết và dung mơi chiết khác nhau. Dung mơi chiết có thể phân cực hoặc khơng phân cực, ví dụ nƣớc, ethanol, methanol, n- hexane, ethyl acetate [13].
Bảng 1.2. So sánh các phƣơng pháp tách chiết truyền thống [13] Phƣơng pháp Đặc điểm Ƣu điểm Nhƣợc điểm Ngâm, truyền, thấm và sắc
- Ngâm là phƣơng pháp lấy bột thực vật ngâm với dung mơi nhiệt độ phịng ít nhất 3 ngày để giải phóng các chất phytochemical hịa tan. Sau đó, hỗn hợp này đƣợc lọc qua màng lọc, tùy thuộc vào loại chiết mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp.
- Truyền và sắc có quy trình tƣơng tự nhƣ quá trình ngâm nhƣng thời gian nhanh hơn.
- Thẩm thấu có nguyên tắc tƣơng tự 3 Dễ dàng và đơn giản Bã của mẫu cịn lại sau khi chiết vẫn chứa dung mơi
phƣơng pháp trên. Ở phƣơng pháp này mẫu đƣợc ngâm trong 2 giờ.
Chiết bằng máy chiết
Soxhlet
Mẫu mịn đƣợc đặt trong một túi xốp hoặc "bao" đƣợc làm từ giấy lọc hoặc xenlulô đƣợc đặt trong buồng của thiết bị Soxhlet. Dung môi chiết xuất đƣợc đun nóng trong bình đáy và bay hơi vào buồng mẫu, ngƣng tụ trong bình ngƣng và nhỏ giọt. Khi lƣợng chất lỏng tiếp cận cánh tay siphon, dung dịch trong bình cạn và quá trình này tiếp tục.
Chỉ cần một lƣợng nhỏ dung môi Dễ cháy, tốn kém, gây ô nhiễm
Bảng 1.3. So sánh các phƣơng pháp tách chiết hiện đại [13] Phƣơng
pháp
Đặc điểm Ƣu điểm Nhƣợc điểm
Chiết bằng lị vi sóng (MAE)
Lị vi sóng tƣơng tác với cực của vật liệu phân cực và cực có thể gây nóng ở gần bề mặt của vật liệu và nhiệt đƣợc truyền bằng cách dẫn truyền ion và quay lƣỡng cực.
MAE có thể đƣợc coi là phƣơng pháp có lợi cho các phân tử phân cực và dung mơi có hằng số điện mơi cao.
Thời gian tách chiết giảm Cải thiện sự phục hồi của chất phân tích Hạn chế các hợp chất phenolic nhỏ Chiết bằng sóng siêu âm (UAE) Sử dụng sóng siêu âm từ 20kHz đến 2000 Hz để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và mẫu và độ thấm của thành tế bào. Nhƣ vậy tính chất của tế bào thay đổi tế bào để giải phóng các hợp chất và tăng cƣờng sự vận chuyển khối lƣợng của dung môi vào tế bào thực vật. Thời gian tách chiết nhanh. Sử dụng ít dung mơi Chi phí thấp Sóng siêu âm trên 20kHz có thể có ảnh hƣởng đến các chất thơng qua sự hình thành của các gốc tự do. 1.3.2. Tách chiết protodioscin
Protodioscin đã đƣợc Dong và cộng sự (2004) tách chiết sử dụng phƣơng pháp chiết bằng ethanol. Hai hợp chất tách ra là dioscoreside và protodioscin đã thể hiện hoạt tính sinh học chống lại một dòng tế bào ung thƣ phổi [18]. Ngoài ra, protodioscin đã đƣợc Shishovska và cộng sự (2015) tách chiết sử dụng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò Diode-Array. Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện là 16µg và giới hạn định lƣợng là 48.6µg trong 1gam lá Bạch tật lê [46]. Sarvin và cộng sự (2017) đã thực hiện so sánh các phƣơng pháp tách chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê sử dụng các phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm (UAE), Reflux Extraction (RE), low pressure reflux Extraction (LPRE) và Soxhlet
(SE). Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi protodioscin lần lƣợt là 99 ± 2, 98 ± 2, 97 ± 3, 96 ± 4% tƣơng ứng với các phƣơng pháp UAE, LPRE, RE, SE [45].
Ở Việt Nam các nghiên cứu về cây Bạch tật lê cũng nhƣ protodioscin còn hạn chế, các tác giả chủ yếu tập trung vào việc xác định hàm lƣợng một số chất trong cây Bạch tật lê nhƣ Nguyễn Thế Chiến và cộng sự (2008), các tác giả phân lập một hợp chất spirostanol saponin là tribulosin. Tuy nhiên chƣa xác định tính chất của hợp chất này [2]. Bùi Đình Thạch và cộng sự (2011) cũng điều tra và xác định hàm lƣợng tribulosin từ cây Bạch tật lê tại các vùng miền khác nhau trong nƣớc [1]. Trong dân gian Bạch tật lê đƣợc sử dụng trực tiếp bằng cách sắc uống toàn cây Bạch tật lê nhằm tăng cƣờng chức năng sinh lí. Tuy nhiên chƣa có cơng trình trong nƣớc nào sử dụng trực tiếp protodioscin để làm thuốc.
Bảng 1.4. Dung mơi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ dƣợc liệu
Độ phân cực Dung mơi Phân nhóm hóa học chiết Thấp
Trung Bình
Cao
Chloroform Terpenoid, Flavonoid, Alcaloid, Aglycogen Cyclohexan Sáp, chất béo
Hexan Sáp, chất béo
Dichloromethan Terpenoid, Flavonoid, Alcaloid, Aglycogen Diethylether Alcaloid, Aglycogen
Ethylacetat Alcaloid, Aglycogen, Glucosid Aceton Flavonoid, Alcaloid, Aglycogen
Ethanol Tannin, Polyphenol, Flavonoid, Terpenoid, Sterol, Alcaloid, polyacetylen
Methanol Saponin, Tanin, Phenon, Flavon, Đƣờng, Aminoacid, Anthrocyanidin, Terpenoid, Xanthoxyllin, Totarol, Lactone, Polyphenol Nƣớc Đƣờng, Aminoacid, Saponin, Tanin, Lectin,
Terpenoid, Anthrocyanidin, Tinh bột, Polypeptid
Về nguyên tắc, để chiết đƣợc các chất phân cực (alkaloid, glycoside, ...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Mà ethanol, methanol và nƣớc đều là những dung mơi có độ phân cực cao.
Nƣớc là dung môi thông dụng, dễ kiếm, giá thành rẻ. Dễ thấm vào dƣợc liệu do có độ nhớt thấp và sức căng bề mặt nhỏ. Có khả năng hịa tan muối alkaloid, một số glycosid, đƣờng, chất nhầy, pectin, chất màu, các acid, các muối vô cơ, enzyme,... Tuy nhiên khả năng hòa tan rộng nên dịch chiết có nhiều tạp chất, tạo môi trƣờng cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển, dịch chiết khó bảo quản. Có thể gây thủy phân một số hoạt chất (glycosid, alkaloid). Nƣớc có độ sơi cao nên khi cô đặc dịch chiết, nhiệt độ sẽ làm phân hủy đi một số hoạt chất.
Trên thực tế, ethanol ở các nồng độ khác nhau là dung môi đƣợc sử dụng nhiều nhất do hịa tan đƣợc nhiều nhóm hoạt chất, khơng độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Ethanol hòa tan đƣợc alcaloid, một số glycosid, tinh dầu, nhựa, ít hịa tan các tạp chất nên có khả năng hịa tan chọn lọc. Có thể pha lỗng với nƣớc ở bất kỳ tỉ lệ nào, nên có thể pha lỗng ethanol thành những nồng độ khác nhau theo yêu cầu chiết xuất đối với từng loại dƣợc liệu. Ethanol có nồng độ >20% có khả năng bảo quản, ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc phát triển. Nhiệt độ sôi thấp nên khi cơ đặc dịch chiết, hoạt chất ít bị phân hủy. Ethanol cao độ làm đơng vón các chất nhầy, albumin, gơm, pectin… nên còn dùng để loại tạp chất. Tuy nhiên ethanol là một chất dễ gây cháy nổ. Nên việc sử dụng trong phịng thí nghiệm cần phải thực hiện hết sức nghiêm ngặt về nội quy an tồn phịng thí nghiệm.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Cây Bạch tật lê (thân, quả, rễ) khô đƣợc lấy từ vùng trồng Bạch tật lê theo tiêu chuẩn VietGAP của Viện Ứng dụng Công nghệ tại Ninh Thuận. Cây đƣợc thu vào tháng 9, khi quả ngả sang màu hơi vàng.
Hình 2.1. Mẫu cây Bạch tật lê đƣợc phơi khơ và mẫu đã khơ
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
- Dung môi kỹ thuật: Methanol, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n- hexane (Hàn Quốc, Indonesia), cồn thực phẩm, nƣớc cất 1 lần.
- Dung mơi phân tích HPLC: methanol, acetonitrile, nƣớc tinh khiết HPLC (Fisher)
- Bột sắc ký silica gel pha thƣờng, pha đảo C-18, sephadex LH-20, dianion HP20
- Bình chiết thuỷ tinh 10, 5, 2, 1 lít - Cột sắc ký thuỷ tinh
- Bình cầu thuỷ tinh cất quay. - Bình định mức loại 25mL. - Máy xay mẫu
- Máy cất quay chân không - Bể siêu âm
- Bộ lọc busne, máy bơm hút chân không. - Phễu chiết phân lớp
- Chất chuẩn Protodioscin 98% (TRC, Canada).
- Máy LC-MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems. - Cột sắc ký HPLC: Cột VertiSep GES C18 (150x4,6 mm; 5μm) và cột bảo vệ GES C18 của hãng Vertical.
- Máy siêu âm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch tật lê
Để lựa chọn dung môi chiết phù hợp nhất, mẫu Bạch tật lê (2 kg) đƣợc xay thành bột mịn và ngâm chiết với các dung môi khác nhau methanol, ethanol 95%, 50% và nƣớc. Chiết mẫu bằng cách ngâm chiết ở điều kiện thƣờng, đun hồi lƣu trong 2 giờ và ngâm chiết kết hợp siêu âm với thời gian ngâm chiết khác nhau. Sau đó hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc và máy cô quay để thu cặn ethanol, methanol, nƣớc khô. Mẫu đƣợc chiết lần lƣợt 4 lần. Dịch chiết của các lần chiết đƣợc cất loại dung môi để cân so sánh khối lƣợng cao chiết thu đƣợc. Ký hiệu là cao chiết A.
2.2.2. Phương pháp lựa chọn phương pháp chiết (kiểu chiết), nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch tật lê
Từ lƣợng Bạch tật lê tổng số ban đầu (2kg) đƣợc chiết bằng các phƣơng pháp đun hồi lƣu (~95ºC trong 2h), ngâm cách thuỷ 80ºC trong 2h, siêu âm (40ºC trong 0,5 giờ) và ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng trong 24h). Thu lấy cao chiết tiến hành cân khối lƣợng và so sánh hiệu suất của từng phƣơng pháp.
Với phƣơng pháp đã đƣợc lựa chọn, thời gian chiết và nhiệt độ chiết đƣợc tối ƣu bằng cách chiết trong các nhiệt độ (95ºC, 80o
C và 60oC) và thời gian (2h, 3h và 4h). Cân và so sánh lƣợng cao chiết thu đƣợc để tìm ra điều kiện tối ƣu cho phƣơng pháp chiết.
2.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch tật lê