3.1.2 .Tổng hợp (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)thiosemicarbazide
3.4. Hoạt tính sinh học của 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
3.4.1. Khả năng kháng trực khuẩn Gram(-), cầu khuẩn Gram(+), nấm men và nấm sợ i
a) Hoá chất và vi trùng
thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hồn tồn.
+ Mơi trường thử: Miieller-Hinton(MH), Sabourous(SBR), thạch tương (TT). + Vi trùng:
- Vi khuẩn Gram(-): Escherichia coli ( ATCC 25992), Pseudomonas aeruginosa ( ATCC 25922).
- Cầu khuẩn Gram(+): Bacillus subtillis ( ATCC 27212), Staphylococcus aureus ( ATCC12222).
- Nấm sợi: Aspergillus niger (439), Fusarium oxysporum (M42).
- Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cereviside (SH20).
b) Cách làm:
Láng vi khuẩn và nấm đã nuôi cấy lên bề mặt của môi trường (MH, SBR, TT) trên đĩa canh thang nuôi cấy qua đêm ở tủ ấm 37oC, đục lỗ và nhỏ thể tích dung dịch tương ứng ( 50 l) dung dịch chất thử, để trong tủ ấm 37oC khoảng 18-24 giờ, sau đó đọc kết quả bằng việc đo đường kính vịng vơ khuẩn (tính bằng mm), phối hợp với các phương pháp tính tốn để khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất này.
Bảng 3.14. Hoạt tính kháng khuẩn của các 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glycopyranosyl)thiosemicarbazon
c) Nhận xét chung:
Tác dụng kháng vi khuẩn Gram(-): Escherichia coli ( ATCC 25992), Pseudomonas aeruginosa ( ATCC 25922), cầu khuẩn Gram(+): Bacillus subtillis (
ATCC 27212), Staphylococcus aureus ( ATCC12222), nấm sợi: Aspergillus niger
(439), Fusarium oxysporum (M42), nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cereviside (SH 20); của một số 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
glycopyranosyl)thiosemicarbazon được xác định bằng việc đo độ lớn bán kính vịng vơ khuẩn theo phương pháp khuếch tán thạch tế bào [5,6]. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 50 μg/ ml các thiosemicarbazon trên đều không thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram(-):
Escherichia coli ( ATCC 25992), Pseudomonas aeruginosa ( ATCC 25922), cầu khuẩn
Gram(+): Bacillus subtillis ( ATCC 27212), nấm sợi: Aspergillus niger (439), Fusarium
oxysporum (M42), nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cereviside (SH 20). Riêng camphor 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl)thiosemicarbazon và cinamaldehyd 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl)thiosemicarbazon có khả năng kháng cầu khuẩn Gram(+):
Staphylococcus aureus ( ATCC12222).
3.3.2 Tác dụng chống oxy hoá
a) Chuẩn bị mẫu.
Các hợp chất 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glycopyranosyl)thiosemicarbazon và chất chuẩn acid ascorbic được pha trong ethanol (96%) thành các dung dịch có nồng độ 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; và 12,0 μM. DPPH được pha trong ethanol (96%) thành dung dịch có nồng độ 150 μM bằng cách hòa tan 5,9 mg DPPH trong 100 ml ethanol (96%).
b) Phương pháp tiến hành
Trên đĩa ELISA 96 giếng, sử dụng micropipet thêm lần lượt 5 µL các dung dịch mẫu thử, chất chuẩn (positive control) đã pha sẵn vào các giếng thử có chứa 195 µL dung dịch DPPH 150 μM. Các giếng chứa mẫu DPPH đối chứng (negative control) được pha bằng cách thêm 5µL ethanol trong 195 µL dung dịch DPPH 150 μM. Mẫu trắng (blank sample) là các giếng chứa 200µL ethanol. Lắc nhẹ đĩa cho các dung dịch trộn đều vào nhau và đưa vào buồng ủ ở 25oC trong vòng 30 phút. Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch trong các giếng thu được tại bước sóng 515 nm. Thí nghiệm được
c) Kết quả và thảo luận
Tác dụng chống oxy hoá của các 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glycopyranosyl)thiosemicarbazon được khảo sát dựa theo phương pháp bắt giữ gốc tự do DPPH. Phương pháp này được phát triển bởi Blois dựa vào tính bền vững của gốc tự do DPPH. Ở trạng thái gốc tự do, cặp electron tự do trên nguyên tử N được giải tỏa bởi sự liên hợp tồn phân tử. Chính vì vậy, mà nó ít bị dime hóa như các gốc tự do bình thường và có thể tồn tại ở dạng đơn phân tử. Một đặc điểm nữa đó là ở trạng thái gốc tự do, DPPH có màu tím, hấp thụ tử ngoại với băng sóng cực đại trong dung dịch ethanol ở khoảng 515 nm. Khi có mặt chất có khả năng bắt gốc tự do, DPPH sẽ chuyển sang dạng khử và màu tím sẽ nhạt dần, chuyển sang màu vàng nhạt, độ hấp thụ thay đổi. Dựa trên sự khác biệt này người ta có thể tính lượng gốc tự do DPPH bị chuyển sang dạng khử (bị bắt giữ) từ đó cho phép đánh giá giá trị chống oxy hoá của chất thử. Phép thử được tiến hành trên các đĩa ELISA 96 giếng và đo độ hấp thụ.
Giá trị khả năng bắt giữ gốc tự do SC% (Scavenging capacity %) (hiệu quả ức chế) được tính theo cơng thức:
Độ lệch tiêu chuẩn ζ được tính theo cơng thức của Ducan như sau:
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50.
Từ giá trị hiệu quả ức chế nhận được, xây dựng đồ thị phụ thuộc giữa hiệu quả ức chế và nồng độ chất thử, xử lý số liệu trên excel và phần mềm GraphPad Prism (version 5.0) để tính tốn giá trị % gốc tự do bị bắt giữ 50% (SC50) của mỗi mẫu thử (Bảng 3.15). Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học được
dẫn tra trong Hình 3.26.
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH
y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ật độ q ua ng h ọc (O D )
Hình 3.26. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học.
Bảng 3.15 Giá trị hiệu quả bắt giữ gốc tự do (SC) của các 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β- D-glycopyranosyl)thiosemicarbazon
Kết quả nhận được cho thấy, các hợp chất tổng hợp đều thể hiện khả năng bắt gốc tự do nhất định mặc dù yếu hơn chất chuẩn. Trong số các thiosemicarbazon đã tổng hợp
menthone 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranozyl)thiosemicarbazon có khả năng bắt gốc tự do tốt nhất, cịn camphor 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl)thiosemicarbazon có khả năng bắt gốc tự do yếu nhất. Như vậy, ta có thể thấy rằng, mạch liên kết -NHC(=S)NHN=C< có vai trị như nhóm bắt gốc tự do. Khi có mặt các hợp phần aldehyd, keton thiên nhiên thì chúng cũng thể hiện sự ảnh hưởng đến vai trò này.
KẾT LUẬN
1. Đã tổng hợp được (2,3,4,6-tetra-O-acetyl- - D-glucopyranosyl)thiosemicarbazide từ
(2,3,4,6-tetra-O-acetyl- -D-glucopyranosyl)isothiocyanat, và (2,3,4,6-tetra-O-acetyl- -D- galactopyranosyl)thiosemicarbazide từ (2,3,4,6- tetra-O-acetyl- -D- galactopyranosyl)isothiocyanat.
2. Đã tổng hợp được 5 hợp chất 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl- -D- glycopyranosyl)thiosemicarbazon của cinamaldehyd, menthone, camphor.
3. Đã xác định cấu trúc của các thiosemicarbazon tổng hợp được bằng các phương pháp vật lí hiện đại như phổ IR , phổ 1H NMR,13C NMR, kết hợp kĩ thuật phổ 2D NMR (COSY, HSQC, HMBC), phổ ESI-MS.
4. Đã thử hoạt tính kháng khuẩn của các (2,3,4,6-tetra-O-acetyl- -D- glycopyranosyl)thiosemicarbazon của các aldehyd, keton thiên nhiên. Kết quả cho thấy camphor 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon và cinamaldehyd 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon có khả năng kháng cầu khuẩn Gram(+): Staphylococcus aureus ( ATCC12222).
5. Đã thử hoạt tính chống oxy hoá của các (2,3,4,6-tetra-O-acetyl- -D- glycopyranosyl)thiosemicarbazon của các aldehyd, keton thiên nhiên đã tổng hợp. Kết quả cho thấy menthone 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranozyl)thiosemicarbazon và menthone 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranozyl)thiosemicarbazon có khả năng bắt gốc tự do tốt nhất, cịn camphor 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl)thiosemicarbazon có khả năng bắt gốc tự do yếu nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1980), Cơ sở hóa học hữu cơ, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, tr. 111, 127.
2. Đặng Như Tại (1998), Cơ sở hóa học lập thể, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr. 24. 3. Nguyễn Minh Thảo (2001), Tổng hợp hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia Hà
Nội, Hà Nội, tr. 77.
4. Lê Huy Chính, Nguyễn Vũ Trung (2005), Cẩm nang vi sinh vật y học, NXB
Y học, Hà Nội.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quiến, Nguyễn Văn Ty (2003), Vi sinh vật
học, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr. 25.
6. Nguyễn Thị Kim Giang (2008), Nghiên cứu tổng hợp và tính chất của một số
axetophenon glucopyranozyl thiosemicacbazon, Luận văn thạc sĩ khoa học,
tr.40.
Tiếng Anh
7. Asha Budakoti, Mohammad Abid and Amir Azam, Assony S. J. (1961), “The chemistry of isothiocyanat”, Organic chemistry of sulfur
compounds, Ed. Kharasch. N, Oxford, Vol. 9, pp. 326-327.
8. Baldini M., Belicchi-Ferrari M., Bisceglie F., Dall'Aglio P. P., Pelosi G., Pinelli S., Tarasconi P., (2004), “Copper(II) Complexes with Substituted Thiosemicarbazones of -Ketoglutaric Acid: Synthesis, X-ray Structures, DNA Binding Studies, and Nuclease and Biological Activity”, Inorganic chemistry, Vol 43(22), 7170-7179.
9. Camarasa M. J., P. Fernandez-Resa P. , Garcia-Lopez M. T. , de las Heras F. G. , Mendez-Castrillon P. P. , and San Felix A., (1984), “A New Procedure for the Synthesis of Glycosyl Isothiocyanates”, Synthesis, pp.
10. Casas J. S., Castellano E. E., Ellena, J., Garcia Tasende, M. S., Sanchez, A., Sordo, J., Vidarte M. J. (2003), Compositional and Structural Variety of Diphenyllead(IV) Complexes Obtained by Reaction of Diphenyllead Dichloride with Thiosemicarbazones, Inorganic chemistry, Vol 42(8), 2584-2595.
11. Castiđeiras A. , Bermejo E. , Valdes-Martínez J. , Espinosa-Pérez G. and West D. X. (2000),“Structural study of two N(3)-substituted thiosemicarbazide copper(II) complexes”, Journal of Molecular Structure, Vol 522, Issues 1-3, pp. 271-278.
12. Dolman S. J., Gosselin F., O'Shea P. D., Davies I. W. (2006), “Superior Reactivity of Thiosemicarbazides in the Synthesis of 2-Amino-1,3,4- oxadiazoles”, J. Org. Chem, 71(25), pp. 9548-9551.
13. Gülhan Turan-Zitouni, Zafer Asım Kaplancıklı, Mehmet Taha Yıldız, Pierre Chevallet and Demet Kaya (2005),“Synthesis and antimicrobial activity of 4-phenyl/cyclohexyl-5-(1-phenoxyethyl)-3-[N-(2- thiazolyl)acetamido]thio-4H-1,2,4-triazole derivatives”, European
Journal of Medicinal Chemistry, Vol 40, Issue 6, pp. 607-613.
14. Hansch C., Leo A., Hoekman D. (1995), Exploring QSAR. I. Fundamental
and applications in chemistry and biology, ACS Press, New York,pp. 545.
(b) Hansch C., Leo A., Hoekman D. (1995), Exploring QSAR. II. Hydrophobic, electronic, and steric constants, ACS Press, New York, pp.
348.
15. Katritzky A.R., Rees C.W. (1984), Comprehensive Heterocyclic
Chemistry, Pergamon Press Ltd. Oxford, vol. 3, pp. 58 - 155. (b) Katritzky
A.R., Rees C.W. (1984), Comprehensive Heterocyclic Chemistry, New
York, Vol 6, pp. 236 - 330.
16. Keiji Funatogawa, Motohiro Matsuura, Masayasu Nakano, Makoto Kiso and Akira Hasegawa, (2011), "Relationship of Structure and Biological Activity of Monosaccharide Lipid A Analogues to Induction of Nitric Oxide Production”, American Society for Microbiology, pp.66.
17. Lech Ciszewski, Daquiang Xu, Oljan Repič and Thomas J. Blacklock (2004), “Reductive alkylation of thioureas: a highly practical synthesis of unsymmetrical N,N′-disubstituted thioureas”, Tetrahedron Letters, Vol. 45, Iss. 43, pp. 8091-8093.
18. Liu H.-L., Li Z. and Anthonsen T. (2000), “Synthesis and Fungicidal Activity of 2-Imino-3-(4-arylthiazol-2-yl)-thiazolidin-4-ones and Their 5- Arylidene Derivatives”, Molecules, Vol 5, pp.1055-1061.
19. M Campana, C Laborie, G Barbier, R Assan and R Milcent (1991), “Synthesis and cytotoxic activity on islets of Langerhans of benzamide thiosemicarbazone derivatives”, European Journal of Medicinal Chemistry, Vol 26, Issue 3, pp. 273-278.
20. Marisa Belicchi Ferrari, Franco Bisceglie, Giorgio Pelosi, Pieralberto Tarasconi, Roberto Albertini and Silvana Pinelli (2001), “New methyl pyruvate thiosemicarbazones and their copper and zinc complexes: synthesis, characterization, X-ray structures and biological activity”,
Journal of Inorganic Biochemistry, Vol 87, Issue 3, 1, pp. 137-147.
21. Marisa Belicchi Ferrari, Silvia Capacchi, Gioia Reffo, Giorgio Pelosi, Pieralberto Tarasconi, Roberto Albertini, Silvana Pinelli and Paolo Lunghi (2000) “Synthesis, structural characterization and biological activity of p-
fluorobenzaldehyde thiosemicarbazones and of a nickel complex”,
Journal of Inorganic Biochemistry, Vol 81, Issues 1-2, pp. 89-97.
22. Martin Ahnoff, Karin Balmér and Yvette Lindman (1992), “By-products in the derivatization of amines with the chiral reagent 2’,3’,4’,6’-tetra-O- acertyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate and their elimination”, Journal
of Chromatography A, Vol 592, Issues 1-2, pp. 323-329.
23. Mohammad Abid and Amir Azam (2005), “1-N-Substituted Thiocarbamoyl-3-Phenyl-2-Pyrazolines: Synthesis and In Vitro Antiamoebic Activities”, European Journal of Medicinal Chemistry, Vol
40, Issue 9, pp. 935-942.
Naturals Product by o-Dianisidine”, Journal of Chromatographia, pp. 447-451.
25. Prata C., Mora N., Lacombe J.-M., Maurizis J.-C., Pucci B. (1999), “Synthesis and suface-active properties of glicosyl carbamates and thioureas”, Carbohydr. Res., pp. 4-14.
26. Richardson D. R., Sharpe P. C., Lovejoy D. B., Senaratne D., Kalinowski D. S., Islam M., Bernhardt P. V., (2006), “Dipyridyl Thiosemicarbazone Chelators with Potent and Selective Antitumor Activity Form Iron Complexes with Redox Activity”,Journal Medicinal Chemistry, Vol 49(22), 6510-6521.
27. Ruchi Singh, Prem Shanker Mishra, Rakhi MishraRuchi Singh, (2011), “Synthesis and Evaluation of Biological activities of Thiosemicarbazones derivatives”, International Journal of PharmTech Research, Vol.3,
pp.1625-1629.
28. Sangita Sharma, Fareeda Athar, Mannar R., Maurya and Amir Azam (2005), “Copper(II) complexes with substituted thiosemicarbazones of thiophene-2-carboxaldehyde: synthesis, characterization and antiamoebic activity against E. histolytica”, European Journal of Medicinal Chemistry, Vol 40, Issue 12, pp. 1414-1419.
29. Shah S. N. and Chudgar N. K., (2000), Thermolysis of Semicarbazones to the Corresponding Azines Through Reactive N-Substituted Isocyanate Intermediates, Molecules, Vol 5, pp. 657-664.
30. Sriram, D., Yogeeswari, P., Thirumurugan, R., Pavana, R. K., (2006),” Discovery of New Antitubercular Oxazolyl Thiosemicarbazones”, Journal
Medicinal Chemistry, (Letter), Vol 49(12), pp. 3448-3450.
31. Umesh B., Gangadharmath, Satish M. Annigeri, Anil D. Naik, Vidyanand K. Revankar and Vinayak B. Mahale, (2001), “Synthesis, characterisation and evaluation of molecular-orbital parameters, spin-orbit, dipolar and fermi-contact terms of VO2+ ion in thiosemicarbazone complexes”,
61-71.
32. Uphadyaya J.S. and Upadhyaya S.K. (1976), “Thin-layer chromatographic separation of the potential antituberculous agents N-aryl-N′p- methylbenzenesulphonyl thiosemicarbazides”, Journal of Chromatography A, Vol 152, Issue 2, pp. 595-596.
33. Vogel Arthur (1989), A Text-Book of Practical Organic Chemistry, 5th ediction, London, pp. 1545.
34. Witczak Z.J. (1986), “Monosaccharide Isothiocyanates: Synthesis, Chemistry, and Preparative Applications” , Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 44, pp. 91 – 145.
35. Yogeeswari P. , Sriram D. , Saraswat V. , Vaigunda Ragavendran J. , Mohan Kumar M. , Murugesan S. , Thirumurugan R. and Stables J. P. (2003), “Synthesis and anticonvulsant and neurotoxicity evaluation of N4- phthalimido phenyl (thio) semicarbazides”, European Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 20, Issue 3, pp. 341-346.
36. Yu Xin LI, Zheng Ming LI, Wei Guang ZHAO, Wen Li DONG, Su Hua WANG, (2006), “Synthesis of novel 1-Arylsunfonyl-4-(1’-N-2’,3’,4,6’- tetra O-acetyl- -D-glucopyranosyl)thiosemicarbazides”, Chinese Chemistry Letter, 17(2), pp. 153-155.
Phụ lục 13. Phổ HSQC của hợp chất menthone 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl)thiosemicarbazon
Phụ lục 17. Phổ HMBC của hợp chất menthone 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl)thiosemicarbazon
Phụ lục 21. Phổ ESI-MScủa hợp chất camphor 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
Phụ lục 23. Phổ 1H NMR của cinamaldehyd 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- galactopyranosyl)thiosemicarbazon
Phụ lục 25. Phổ ESI-MS của cinamaldehyd 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- galactopyranosyl)thiosemicarbazon