.Thử nghiệm in vitro hoạt tính sinh học gâyđộc tế bào

Các hợp chất (III a-h) đƣợc nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính độc tế bào trên các dịng tế bào ung thƣ:

a. Fl: Ung thƣ tử cung.

b. MCF7: Ung thƣ biểu mô vú.

c. RD: Ung thƣ cơ vân tim – dạng ung thƣ mô liên kết. 0,839 Complement factor D inhibitor

0,782 CYP2A6 inhibitor

d. HepG2: Ung thƣ gan ngƣời. e. Lu: Ung thƣ phổi

Phƣơng pháp phân tích theo phƣơng pháp của Skehan (1990) và Likhiwitayawuid và các cộng sự (1993) hiện đang đƣợc áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI) và trƣờng Đại học Dƣợc, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.

Từ các kết quả khảo sát thí nghiệm in vitro, nhận thấy các sản phẩm (III a-h) có chứa đồng thời vịng aza-14-crao-4-ete và vịng γ-arylpyridin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thƣ: FL- Ung thƣ tử cung; MCF7- Ung thƣ biểu mô vú); RD- Ung thƣ cơ vân tim; HepG2- Ung thƣ gan ngƣời. Khơng thể hiện hoạt tính trên dịng tế bào ung thƣ Lu- Ung thƣ phổi. Cụ thể, các dẫn xuất (IIIc) và (IIId) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh, trong đó, hợp chất (IIIc) có tác dụng ức chế tế bào ung thƣ dòng RD (ung thƣ cơ vân tim) và hợp chất (IIId) có tác dụng ức chế cả bốn dòng tế bào ung thƣ là FL, MCF7, RD, HepG2.

Đặc biệt tế bào ung thƣ RD khơng có khả năng sống sót (0%) dƣới tác dụng của (IIId) với nồng độ 5μg/ml (bảng 2.5).

Bảng 2.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào dựa trên khả năng sống sót của tế bào ung thư

TT Ký hiệu Nồng độ của mẫu (μg/ml) Dòng tế bào (Cell survival - %) Kết luận Hep-G2 MCF7 RD FL Lu DMSO 100,0±0, 0 100,0±0, 0 100,0±0, 0 100,0±0, 0 100,0± 0,0 Chứng (+) 5 0,7±0,1 1,5±0,3 1,1±0,2 2,5±0,07 2,8±0, 4 Dƣơng tính 1. IIIa 5 98,50,9 97,50,7 99,20,5 96,31,1 99,71 ,2 Âm tính 2. IIIb 5 71,5±0,7 87,6±1,5 71,6±0,2 76,7±0,7 94,50 ,9 Âm tính 3. IIIc 5 56,5±0,2 5 90,8±0,7 26,8±0,3 74,1±0,5 Dƣơng tính với RD 4. IIId 5 7,1±0,5 42,5±1,1 0,0±0,0 17,8±0,9 92,71 ,3 Dƣơng tính với 04 dịng tế bào 5. IIIf 5 87,8±0,1 91,2±1,3 68,8±0,5 99,5±1,4 Âm tính 6. IIIg 5 70,50,4 87,20,0 6 90,71,3 90,20,5 99,50 ,7 Âm tính

7. IIIh 5 90,70,5 91,51,0

1 96,30,9 97,30,7 98,81

,3 Âm tính

2.4.3. Thử hoạt tính chống oxy hóa

Phản ứng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K. và các cộng sự (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch etanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hồ hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cƣờng độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hố đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bƣớc sóng 515 nm.

Chúng tơi tiến hành thăm dò khả năng bắt gốc tự do của ngẫu nhiên hai trong các sản phẩm thu đƣợc. Kết quả cho thấy hai mẫu (IIIa) và (IIIe) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tƣơng đối kém, do đó, khả năng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất trong nhóm có thể khơng cao.

Bảng 2.6.Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa

TT Kí hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/ml) SC% SC50 Kết quả 1 1 Chứng (+) 50 86,20,04 25,4 Dƣơng tính 2 2 Chứng (-) - 0,00,0 - Âm tính 3 3 IIIa 200 1,20,06 - Âm tính 4 IIIe 200 0,50,0 - Âm tính

CHƢƠNG 3- THỰC NGHIỆM

- Điểm nóng chảy đƣợc đo bằng phƣơng pháp đo mao quản trên máy ghi điểm nóng chảy STUART SMP3 (BIBBY STERILIN- Anh).

- Phổ Hồng ngoại (IR) đƣợc ghi trên máy phổ FTIR MAGNA 760 (NICOLET-US) tại Viện Hoá học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, ép viên với bột KBr.

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR đƣợc ghi trên máy Bruker- 500 MHz tại Viện Hoá học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Dung môi chụp phổ là CDCl3, CD3COCD3...với chất chuẩn nội là TMS.

- Phổ MS đƣợc ghi trên máy AutoSpec Premier và LTQ Orbitrap XL tại phịng thí nghiệm Hố vật liệu-Khoa Hố học- Trƣờng ĐH KHTN-ĐHQGHN.

- Hoạt tính sinh học của các chất đƣợc tiến hành thử nghiệm và đọc kết quả tại phịng Sinh học thực nghiệm- Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3.1. Tổng hợp tiền chất 1,5-bis(2-axetylphenoxy)-3-oxapentan (I)

Cho 40 g KI và 40 g K2CO3 vào bình nón thể tích 250 ml có lắp sinh hàn hồi lƣu và nhiệt kế, sau đó thêm 150 ml DMF và khuấy đều, giữ nhiệt độ hệ ở 30oC trong 20 phút. Thêm từ từ 27 ml 2‟-hydroxyl axetonphenon (a), dung dịch chuyển sang màu vàng chanh, tăng nhiệt độ lên 80oC. Nhiệt độ của hệ phản ứng đƣợc giữ ở 80oC trong 1giờ. Sau đó thêm từ từ 16 g diclodietylete (b) vào dung dịch, thì tiếp

bằng sắc ký bản mỏng thấy phản ứng đã xảy ra hoàn toàn, để nguội hỗn hợp phản ứng đến nhiệt độ phòng rồi đổ vào 1000 ml nƣớc lạnh. Lọc hút kết tủa tạo thành trên phễu lọc Busner, rửa kết tủa nhiều lần bằng nƣớc. Sản phẩm đƣợc kết tinh lại trong etylaxetat, thu đƣợc tinh thể hình kim, màu trắng,có to

nc= 66- 67 (oC), Rf = 0,67 (100% etylaxetat). Hiệu suất phản ứng H= 53%.

3.2. Tổng hợp dẫn xuất (γ-arylpyridino)-dibenzoaza-14-crao-4-ete

3.2.1. Tổng hợp dẫn xuất (γ-phenylpyridino)-dibenzoaza-14-crao-4-ete

a) Tổng hợp (γ-phenylpyridino)dibenzoaza-14-crao-4-ete (IIIa)

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol benzandehit (0,51 ml- 0,53 g) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sôi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xơ đa (30%) đến pH=7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và đƣợc kết tinh lại trong etanol. Thu đƣợc tinh thể (IIIa) màu trắng, khối lƣợng 0,85 g (hiệu suất 42%), có giá trị Rf= 0,61 trong hệ dung mơi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

nc= 160- 1620C.

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol p-metoxy

benzandehit (0,61 ml- 0,68 g) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sơi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xô đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và đƣợc kết tinh lại trong etanol, thu đƣợc 0,88 g (hiệu suất 40%). Tinh thể (IIIb) có giá trị Rf= 0,50 trong hệ dung môi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

nc= 110- 1110C.

c) Tổng hợp (γ-(2-hydroxyphenyl)pyridino)dibenzoaza-14-crao-4-ete (IIIc)

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol o-hydroxyl

benzandehit (0,61 g- 0,53 ml) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sơi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xơ đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm sau khi đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và kết tinh lại trong etanol có khối lƣợng 0,77 g (hiệu suất 37%). Tinh thể (IIIc) màu trắng có giá trị Rf= 0,63 trong hệ dung mơi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

nc= 225- 2260C.

d) Tổng hợp (γ-(4-clorophenyl)pyridino)dibenzoaza-14-crao-4-ete (IIId)

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol p-cloro

benzandehit (0,70 g) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sơi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xơ đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg SO và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp

suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) thu đƣợc khối lƣợng là 0,93 g (hiệu suất 42%). Tinh thể (IIId) màu trắng có giá trị Rf= 0,71 trong hệ dung môi 100% etylaxetat, nhiệt độ nóng chảy T0nc= 138- 1400C.

e) Tổng hợp (γ-(4-nitrophenyl)pyridino)dibenzoaza-14-crao-4-ete (IIIe)

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol p-nitro

benzandehit (0,78 g) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sơi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xơ đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và đƣợc kết tinh lại trong etanol, thu đƣợc khối lƣợng 0,89 g (hiệu suất 40%). Tinh thể (IIIe) màu trắng có giá trị Rf= 0,85 trong hệ dung mơi n-hexan/etylaxetat: 1/1 (v/v), nhiệt độ nóng chảy T0nc= 252- 2530C.

f) Tổng hợp (γ-(4-hydroxyphenyl)pyridino)dibenzoaza-14-crao-4-ete (IIIf)

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol p-hydroxy

benzandehit (0,61 g) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sơi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xô đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và đƣợc kết tinh lại trong etanol, thu đƣợc 0,86 g (hiệu suất 40%). Thu đƣợc tinh thể (IIIf) màu trắng có giá trị Rf= 0,71 trong hệ dung mơi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

nc= 211- 2120C.

benzandehit (0,93 g) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sôi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xơ đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và đƣợc kết tinh lại trong etanol, thu đƣợc 1,10 g (hiệu suất 45%). Tinh thể (IIIg) màu trắng có giá trị Rf= 0,34 trong hệ dung mơi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

nc= 182- 1840C.

h) Tổng hợp (γ-(2-clorophenyl)pyridino)dibenzoaza-14-crao-4-ete (IIIh)

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol o-cloro

benzandehit (0,56 ml- 0,71 g) và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sơi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xơ đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp xuất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và đƣợc kết tinh lại trong etanol, thu đƣợc 0,93 g (hiệu suất 43%). Tinh thể (IIIh) màu trắng có giá trị Rf= 0,42 trong hệ dung mơi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

nc= 172- 1740C.

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol 2-thenandehit (0,50 ml- 0,56 g)và 0,13 mol (10,0g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sôi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xô đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat) và kết tinh lại trong dung môi etanol. Thu đƣợc đơn tinh thể (V) màu trắng, có khối lƣợng 0,96 g, hiệu suất 46%, giá trị Rf= 0,31 trong hệ dung mơi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

nc= 198- 1990C.

3.2.3. Tổng hợp (γ-pyrrolopyridino)dibenzoaza-14-crao-4-ete (VII)

Dung dịch gồm hỗn hợp 5 mmol (1,71 g) dixeton, 5 mmol 1-H-pyrol-2- cacbandehit (0,48 g)và 0,13 mol (10,0 g) amoni axetat trong 9 ml axit axetic băng đƣợc đun sơi hồi lƣu 6 tiếng trong bình tam giác bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc làm lạnh và trung hịa bằng dung dịch xơ đa (30%) đến pH= 7- 9. Sản phẩm phản ứng đƣợc tách chiết bằng dung môi etylaxetat (4*30 ml). Dịch chiết sau khi thu gom, làm khô bằng Mg2SO4 và đƣợc cho bay hơi ở dƣới áp suất thấp. Sản phẩm đƣợc phân tách bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel (dung môi rửa giải bằng etylaxetat. Thu đƣợc tinh thể màu trắng (VII) có khối lƣợng 0,87 g (hiệu suất 44%), có giá trị Rf= 0,42 trong hệ dung môi 100% etylaxetat (EtOAc), nhiệt độ nóng chảy T0

3.3. Thí nghiệm thử hoạt tính sinh học

3.3.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa

Phương pháp phân tích

Phản ứng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và các cộng sự (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hồ hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cƣờng độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ơxy hố đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bƣớc sóng 515 nm.

Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging capacity):

Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu đƣợc đƣa vào chƣơng trình xử lý số liệu Exel theo cơng thức:

OD thí nghiệm - OD mẫu trắng

SC% = [100 - x 100] ±  OD chứng âm tính

Độ lệch tiêu chuẩn  tính theo cơng thức của Ducan nhƣ sau:

( xi - x )2  =

n - 1

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC≥50%) sẽ đƣợc thử nghiệm bƣớc 2 để tìm giá trị SC50

Mẫu đƣợc pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 đƣợc xác định bằng chƣơng trình table curve thơng qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH đƣợc trung hoà bởi chất thử.

3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào:

Các dòng tế bào:

Đƣợc cung cấp từ phòng Sinh học Thực nghiệm – Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, gồm:

- Fl: Ung thƣ tử cung

- MCF7: Ung thƣ biểu mô vú - RD: Ung thƣ mô liên kết - HepG2: Ung thƣ gan ngƣời

Môi trƣờng nuôi tế bào:

Môi trƣờng ni các dịng tế bào ung thƣ:

- Môi trƣờng MEME (Minineal Essential Medium with Eagle‟s salts) bổ sung 7-10% huyết thanh bê tƣơi, 1% dịch kháng sinh PSF (potassium penicillin– streptomycin– fungizone) và 1% NAA (nonessential amino acid).

- Hoặc môi trƣờng DMEM (Dullbecco‟s modified Minimum Essential Medium): 10% huyết thanh bê tƣơi, 1% dịch kháng sinh (PSF), 1% NAA.

- Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penixilin/ml, 100 g streptomyxin sunfat/ml, 0,25 g amphoterixin B/ml.

- Đệm PBS (phosphate bufferred saline, g/L): NaCl 8; KCl 0,2; Na2HPO4 1,15; KH2PO4 0,2; Khử trùng 1 atm trong 30 phút.

Nuôi tế bào ung thƣ in vitro theo Skehan và CS. Xác định hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ theo phƣơng pháp SRB của Likhiwitayawuid và các cộng sự (CS) đang đƣợc tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI). Phƣơng pháp này đã đƣợc phịng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hố học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996.

Phép xác định gồm hai bƣớc nhƣ sau:

Bƣớc 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính