PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
PHẦN II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp
2.2.4. Định danh vi khuẩn dựa vào khóa định loại Bergey
Các chủng thuần khiết thu được sẽ được thử nghiệm về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa. Mặc dù phương pháp này khơng hồn tồn chính xác nhưng đây là bước đầu tiên trong nghiên cứu phân loại vi sinh vật.
Nhuộm Gram
Nhuộm gram là phương pháp thực nghiệm hữu hiệu trong bước đầu tiên xác định vi sinh vật, phân biệt các loài vi khuẩn thành hai nhóm Gram dương và Gram âm dựa trên các đặc tính lý hóa của thành tế bào.
Khả năng sinh bào tử
Xác định khả năng sinh bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn có khả năng sinh hydro được nuôi trong môi trường nuôi cấy 1- 2 ngày. Sau đó đem dịch ni cấy ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 85oC trong 15 phút. Dịch nuôi cấy sau
khi sốc nhiệt được nuôi cấy lại. Nếu thấy vi khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả năng tạo khí thì vi khuẩn có khả năng sinh hydro đó có khả năng tạo bào tử.
Thử nghiệm Catalase
Catalase là enzyme có khả năng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxy (O2). Các thử nghiệm catalase nhằm phát hiện ra sự có mặt các enzyme catalase trong vi khuẩn, nó là thử nghiệm cần thiết để phân biệt catalase âm và catalase dương.
Thử nghiệm khả năng di động
Để xác định khả năng di động của vi khuẩn, cấy khuẩn lạc đâm sâu vào môi trường thạch mềm (0,5% agar) trong ống nghiệm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ ở 37oC từ 18- 24h. Phản ứng dương tính vi khuẩn di động sẽ làm mơi trường đục, sinh trưởng lan ra khỏi vết cấy. Phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ sinh trưởng quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
Thủy phân gelatine
Xác định khả năng sinh enzyme gelatinese làm tan chảy môi trường gelatin. Để phân giải ngoại bào gelatin, các vi khuẩn này phải có khả năng sinh enzyme ngoại bào gelatinese. Chủng vi khuẩn được cấy riêng rẽ vào ống nghiệm. Ủ vi khuẩn ở 37oC trong điều kiện kỵ khí. Sau 5- 7 ngày lấy các ống nghiệm đặt vào tủ nhiệt độ 4oC 1- 2 giờ ở nhiệt độ thấp gelatin sẽ đông lại. Nếu gelatin bị thủy phân thì mơi trường tan chảy, môi trường ở dạng rắn chứng tỏ gelatin không bị thủy phân.
Thử nghiệm Indole
Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân axit amin tryptophan sinh indol, axit pyruvic và NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO)- của p- dimethylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ.
Thử nghiệm hoạt tính Lecithinase
Trộn lòng trắng trứng với cùng trọng lượng nước muối sinh lý tạo thành dịch huyền phù. Lấy 10ml dịch huyền phù trên hịa tan vào mơi trường thạch- peptone đã khử trùng, đổ đĩa Petri. Cấy vi khuẩn thành điểm trên đĩa thạch đặt ở 37oC. Nếu xung quanh và dưới vết cấy có vạch trong là phản ứng dương tính (+), ngược lại phản ứng âm tính (-).
Thử nghiệm Urease
Ure là diamid của axit carbonic dễ bị thủy phân bởi enzyme urease tạo thành amoniac và carbon dioxide, chất chỉ thị pH là phenol đỏ. Phenol đỏ chuyển sang màu hồng trong môi trường kiềm. Kết quả dương tính (+) khi mơi trường chuyển sang màu hồng, âm tính (-) mơi trường khơng đổi màu.
Đồng hóa Citrate
Thử nghiệm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn nitrat như là nguồn carbon duy nhất. Vi sinh vật sử dụng citrate sinh CO2 làm kiềm môi trường. Vi sinh vật sử dụng muối amonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa mơi trường. Phản ứng dương tính (+) mơi trường chuyển sang màu xanh, âm tính (-) mơi trường khơng thay đổi màu sắc.
Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm nhằm phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrome oxidase của vi khuẩn. Hệ thống cytochrome có ở vi khuẩn hoạt động như chất liên kết trong q trình hơ hấp. Phản ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p- phenylenediamine dihydrochloride. Phản ứng dương tính (+) có màu xanh tím, phản ứng âm tính (-) khơng có xuất hiện màu.
Thử nghiệm MR
Thử nghiệm nhằm phát hiện vi sinh vật sản xuất và duy trì các axit bền trong quá trình lên men glucose. Sử dụng chất chỉ thị methyl red. Phản ứng
dương tính (+) càng kéo dài thời gian nuôi cấy, môi trường càng axit, phản ứng âm tính (-) các chất có tính axit bị chuyển hóa, mơi trường dần trung tính.
Thử nghiệm VP
Thử nghiệm phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong q trình lên men glucose. Acetoin được tạo ra trong điều kiện kỵ khí hồn tồn. Phản ứng dương tính (+) mơi trường có màu hồng, phản ứng âm tính (-) mơi trường khơng đổi màu.