Chủng vi khuẩn Sản lượng hydro(ml/L môi trường) OD 600 BO1 449,54 ± 7,56 1,301 ± 0,031 BO2 120,89 ± 5,34 0,428 ± 0,015 BO3 85 ± 4,55 0,387 ± 0,015 BU1 150,26 ± 7,26 0,450 ± 0,052 BU2 74,12 ± 10,6 0,345 ± 0,027 BU3 85,89 ± 4,64 0,396 ± 0,014 BU4 50,37 ± 4,74 0,315 ±0,021 BU5 315,21 ± 13,67 0,950 ± 0,026 BU6 234,21 ± 16,73 0,756 ± 0,009
Tiếp tục lựa chọn các đơn chủng có khả năng sinh hydro ≥ 100ml/L môi trường: BO1, BO2, BU1, BU5, BU6 nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng và định danh chủng.
3.2.2. Đặc điểm hình thái tế bào
Đem 5 đơn chủng BO1, BO2, BU1, BU5, BU6 có khả năng sinh hydro cao nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng và định danh chủng.
Sau khi tiêu bản vi khuẩn được nhuộm Gram và được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần và kính hiển vi điện tử, 5 chủng vi khuẩn có đặc điểm đều là vi khuẩn hình que có độ dài khác nhau.
Hình 3.1: Hình thái tế bào của chủng BO1, BU1
Theo các báo cáo đã công bố, các vi khuẩn sinh khí hydro hầu hết là các vi khuẩn hình que (Oh Y. và cs, 2003; Sakai S. và cs, 2007).Vì vậy, kết quả quan sát được của chúng tơi cho thấy chủng vi khuẩn tạo khí phân lập được cũng có đặc tính chung đó. Ngồi ra, chủng BU2 khi nhuộm cho ra kết quả là vi khuẩn Gram âm, bắt màu hồng safranin khi nhuộm Gram. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã công bố các chủng sinh hydro bao gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Trong đó vi khuẩn Gram dương là chủ yếu (Alalayah và cs, 2009). Điều này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Chủng này tiếp tục được định danh sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Định danh dựa vào khóa phân loại Bergey
Sau khi phân lập được chủng khác nhau, dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, 5 chủng sẽ được đánh giá dựa vào Khóa phân loại Bergey để tuyển chọn những chủng có khả năng sinh hydro.
Kết quả nhuộm Gram cho thấy, 5 chủng vi khuẩn đã phân lập có chủng BO1, BO2, BU5 và BU6 là Gram dương, chủng BU1 là Gram âm, với các đặc tính sinh lý sinh hóa như Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Tính chất sinh lý hóa sinh của các chủng đã phân lập từ phân bò và bùn
Ký hiệu chủng
BO1 BO2 BU1 BU5 BU6
Gram + + - + + Di động + - - - - Catalase - - + - - Urease - - + - - Indole + + - + + Gelatinese + + - + + Lectin + + Citrate + + + + + Oxidase - - - - - MR - + VP + -
Dựa vào khóa định loại Berey các chủng BO1, BO2, BU5, BU6 có các đặc điểm đặc trưng thuộc chi Clostridium như: Gram dương, catalase âm tính, có khả năng sinh bào tử… (Carol L.W. và cs, 1996).
3.2.4. Định danh lồi bằng phân tích 16S rRNA
Sau khi tách chiết DNA genome và tinh sạch, DNA của các chủng vi khuẩn được dùng làm khuôn để nhân bản đoạn gen mã hóa 16S rRNA nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F và 1527R. Sau khi kiểm tra kết quả PCR (Hình 3.2), sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi để giải trình tự gen mã hóa 16S ribosome.
Kết quả điện di genome và sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16s rRNA bằng kỹ thuật PCR, các mẫu ký hiệu và đánh số thứ tự như trong hình có băng rõ nét, khơng bị nhiễu và khơng có băng phụ, kích thước điện di sản phẩm khoảng 1500bp, phù hợp với kích thước của đoạn gen mã hóa 16S rARN của vi khuẩn.
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR
M: Marker(1kb); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương.
Kết quả BLAST các chủng được hiển thị trong Bảng 3.5. Kết quả này đã phản ánh tính chính xác của việc định danh sơ bộ theo khóa phân loại Bergey.
Kết quả giải trình tự khi so sánh với các trình tự gen 16S rRNA của các loài tương đồng trên Genbank cho thấy: chủng BO1 có tỉ lệ tương đồng 100%
so với đoạn 16S rRNAcủa chủng Clostridium beijerinckii PS3, do đó chủng này được đặt tên là Clostridium beijerinckii BO1. Chủng BU1 có tỉ lệ tương đồng 100% so với đoạn 16S rRNAcủa chủng Enterobacter cloacae MCE64A9 trên ngân hàng gen và được đặt tên là Enterobacter cloacae BU1.Chủng BO2 có tỉ lệ tương đồng 99% so với đoạn 16S rRNA của chủng Clostridium sp.SED1
nên chủng này mới chỉ xác định thuộc chi Clostridium, các nghiên cứu để xác định tới lồi cịn cần phải tiến hành tiếp.Chủng BU5 có hệ số tương đồng 99% so với đoạn 16S rRNAcủa chủng Clostridium bifermentans ATCC 638 và
được đặt tên là Clostridium bifermentans BU5. Chủng BU6 có tỉ lệ tương đồng 98% so với đoạn 16S rRNA của chủngClostridium sulfidigenes 113A nên được đặt tên là Clostridium sulfidigenes BU6.
Bảng 1.5: Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Ký hiệu chủng
Tên chủng trên ngân hàng Gen Tỉ lệ tương đồng(%)
BO1 Clostridium beijerinckii PS3 100
BO2 Clostridium sp.SED1 99%
BU1 Enterobacter cloacae MCE64A9 100
BU5 Clostridium bifermentans ATCC 638 99%
BU6 Clostridium sulfidigenes 113A 98%
Nhìn vào kết quả định danh chothấy 4/5 chủng thuộc chi Clostridium. Điều này một lần nữa cho thấy chi Clostridium là chi phổ biến về khả năng
sinh hydro như khẳng định của Calusinska và cs (Calusinska và cs, 2010). Chủng BO1: dựa vào các phương pháp định danh cho thấy chủng BO1 thuộc loài Clostridium beijerinckii - vi khuẩn Gram dương hình que, có khả năng sinh nội bào tử, lên men sinh hydro (Carol L. W. và cs, 1996). Chủng BO1 có khả năng di động, đây cũng là điểm tương đồng với Clostridium
phân bò, nghiên cứu này đã được Patrik R.Jones công bố năm 2008. Dựa vào kết quả Bảng 3.3 cho thấy chủng BO1 là có khả năng sinh trưởng và sinh hydro cao nhất đạt 449,54 ml/l môi trường tại giá trị OD 1,301. Theo The Prokaryotes volume 4, Bacteria: Fimicutes, cyanobacteria, Clostridium beijerinckii là một trong những chủng có khả năng sinh khí hydro cao nhất
trong chi Clostridium. Kết quả này cũng trùng khớp với một số nghiên cứu
trước đó. Một nghiên cứu của Dan An và cộng sự cho thấy Clostridium beijerinckii YA001 cho sản lượng 2,3 mol H2/mol glucose. Do đó chúng tơi
lựa chọn chủng BO1 tham gia vào các nghiên cứu tiếp theo của đề tài.
Chủng BU1: kết quả phân tích trình tự gene16S rRNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng BU2 thuộc loài
Enterobacter cloacae. Đây là lồi thuộc nhóm trực khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí
tùy tiện, Gram âm, có khả năng sử dụng nguồn glucose lên men sinh hydro. Sử dụng Enterobacter cloacae để sản xuất hydro cũng được nhiều nhóm nghiên cứu trước đây (Harun Irina và cs, 2012; Kumar Narendra và cs, 2000).
Chủng BU5: kết quả phân tích trình tự gene16S rRNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng BU3 thuộc loài
Clostridium bifermentans đến 99%. Trên thế giới Clostridium bifermentans
đã được sử dụng để nghiên cứu sinh hydro trong nhiều năm qua (Wang và cs, 2003; Wong và cs, 2014).
Chủng BO2: kết quả phân tích trình tự 16S rRNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng BO2 có nhiều đặc điểm giống với loài Clostridium sp.SED1, tuy nhiên để khẳng định đến loài,
cần những nghiên cứu tiếp theo.
Chủng BU6: kết quả phân tích trình tự gene 16S rRNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng BU1 thuộc loài
Kết quả định danh cho thấy tính chính xác và sự trùng khớp giữa định danh trên khóa phân loại Bergey và định danh bằng phân tích mã trình tự gen mã hóa 16S rRNA. Kết hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử, từ đó chúng tơi có thể khẳng định rằng những kết quả định danh các chủng vi khuẩn sinh hydro là hồn tồn chính xác.
3.2.5. Định danh lồi bằng khối phổ Protein
Các mẫu đã được định danh bằng 2 phương pháp trên được chúng tôi kiểm định tính chính xác một lần nữa bằng phương pháp khối phổ protein với kết quả như sau:
- Các chủng BO1, BU1, BU5 được định danh lần lượt là Clostridium
beijerinckii , Enterobacter cloacae, Clostridium bifermentans. Kết quả này
hoàn toàn trùng khớp với 2 phương pháp sử dụng khóa định loại Bergey và phân tích trình tự gen 16S rRNA.
- Các chủng BO2 và BU1 không xác định được do khơng có dữ liệu. Như vậy kết hợp 3 phương pháp định danh trên, có thể kết luận rằng kết quả phân lập và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro của chúng tơi là hồn tồn chính xác, có độ tin cậy cao.
3.3. Nghiên cứu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến q trình lên men kỵ khí
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến tổng lượng khí biogas sinh ra
Song song với quá trình phân lập chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định sự khác nhau về tổng lượng khí và thể tích khí hydro sinh ra khi lên men phân hủy kỵ khí chất thải lị giết mổ với sự bổ sung nguồn vi sinh vật từ nguồn phân bị và bùn hoạt tính bể kỵ khí.
Nhìn vào Bảng 3.6 ta có thể thấy với nguồn vi sinh vật lấy từ bùn thì ở khoảng pH 4 và pH 5 tổng lượng khí sinh ra thấp từ 205,5- 381 ml/L; ở pH 6 tổng lượng khí tăng lên khoảng 590,58 ml/L. Ở pH 7 tổng lượng khí sinh ra
lớn nhất với giá trị cao nhất là 924,04 ml/L.Tăng pH 8 tổng lượng khí lại giảm cịn khoảng 837,04 ml/L.
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH đến tổng lượng khí sinh ra
pH Tổng khí sinh ra khi sử dụng nguồn vi sinh vật từ bùn (ml/L) Tổng khí sinh ra khi sử dụng nguồn vi sinh vật từ phân bò (ml/L) 4 205.5± 22.66 178.2 ± 17.93 5 381 ± 25.02 309.11 ± 17.61 6 590.58 ± 20.47 470 ± 31.48 7 924.04 ± 35.91 743.13 ± 45. 48 8 837.05 ± 42.1 643.17 ± 20.99
Với nguồn vi sinh vật từ phân bò ở pH 4, tổng lượng khí thu được thấp nhất khoảng 178,2 ml/L, cao nhất ở pH 7 là 743,13 ml/L. Dễ dàng nhận thấy tổng lượng khí sinh ra khi lên men với nguồn vi sinh vật từ bùn nhiều hơn nguồn vi sinh vật từ phân bị là khá lớn, chênh lệch 10-20% (Hình 3.3). Kết quả này cho thấy sự phong phú của hệ vi sinh vật phân hủy kỵ khí từ nguồn nguyên liệu bùn hoạt tính. Nó cũng trùng khớp với kết quả nghiên cứu của chúng tơi trong q trình phân lập khi các nguồn ngun liệu từ bùn tập trung nhiều chủng có khả năng sinh biogas được phân lập hơn, khả năng sinh khí cũng cao hơn.
Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH đến tổng lượng khí sinh ra
Trong phân giải kỵ khí pH có ảnh hưởng lớn đến tổng lượng khí sinh ra do nó ảnh hưởng đến hoạt động của các vi khuẩn tham gia vào quá trình lên men tạo khí. Theo nghiên cứu của Speece (1996), pH tối ưu cho sản xuất biogas nằm trong khoảng 6,5- 8,2. Nghiên cứu của Budiynono và cs (2013) cũng cho thấy kết quả tương tự với nghiên cứu của chúng tôi khi tại pH 7, khí sinh học được hình thành lớn hơn nhiều tại pH 6 và pH 8, đạt 3,81mL/g COD. Điều này có thể giải thích rằng pH ban đầu là 7 có thể giúp hệ vi sinh vật phát triển tốt trong mơi trường lên men kỵ khí, đồng thời khả năng sinh khí biogas cũng cao hơn.
3.3.2. Ảnh hưởng của pH đến lượng khí H2 sinh ra
Dựa vào tổng thể tích khí thu được bằng phương pháp thế nước và phần trăm khí hydro trong hỗn hợp khí đo bằng máy GC, ta tính được thể tích khí hydro sinh ra thể hiện ở Bảng 3.7:
0 200 400 600 800 1000 1200 4 5 6 7 8 T ổ n g k h í si n h r a ( m l/ L ) pH Nguồn vi sinh vật từbùn Nguồn vi sinh vật từphân bò
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến thể tích khí H2 sinh ra pH Thể tích khí H2 sinh ra pH Thể tích khí H2 sinh ra khi sử dụng nguồn vi sinh vật từ bùn (ml/L) Thể tích khí H2 sinh ra khi sử dụng nguồn vi sinh vật từ phân bò (ml/L) 4 25,6 ± 5,7 31,2 ± 4,52 5 169 ± 1,2 152,87 ± 6,61 6 256,25 ± 5,87 247,1 ± 7,33 7 225,2 ± 6,91 221,81 ± 9,35 8 50,9 ± 8,8 29 ± 5,33
Từ Bảng 3.7 ta thấy ở khoảng pH 4 và pH 8 thì thể tích khí H2 sinh ra là ít <50 ml/L. Ở khoảng pH 6- 7 cho lượng H2 cao nhất từ 221,81- 256,25 ml/L. pH là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh khí hydro vì ảnh hưởng đến con đường trao đổi chất cũng như hoạt động của enzyme hydrogenase. Sự giảm nhanh giá trị pH trong môi trường nuôi cấy là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến khả năng sinh trưởng và sản lượng hydro thấp trong q trình ni cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự với một số nghiên cứu trước đó về ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh khí hydro của một số chủng vi khuẩn (Wang và cs, 2003; Pan và cs, 2008). Theo Wang và cs (2003) điều kiện tối ưu cho sinh khí hydro của
Clostridium bifermenans là pH 6. Hay kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị
Thắm (2016), cũng cho kết quả pH tối ưu cho sinh khí của chủng này là 7. Pan và cs (2008) đã báo cáo pH tối ưu cho sản xuất hydro bởi C. beijerinckii Fanp3 ở khoảng giữa pH 6,47- 6,98. Đây cũng là những chủng vi sinh vật mà chúng tôi đã phân lập được trong các mẫu nghiên cứu.
Qua Hình 3.4 ta thấy việc sử dụng nguồn vi sinh vật từ bùn và phân bò lên men kỵ khí sinh H2 cho kết quả tương đối giống nhau, dù cho sử dụng nguồn vi sinh vật từ bùn thì kết quả lượng H2 sinh ra có cao hơn từ phân bị nhưng khơng đáng kể.
Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH đến thể tích khí H2 sinh ra
Kết luận: Quá trình lên men kỵ khí sinh biogas thích hợp nhất trong khoảng pH 7- 8 nhưng để tạo ra sản lượng H2 lớn hơn thì khoảng pH thích hợp là pH 6- 7.
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Trong thí nghiệm này chúng tơi lựa chọn chủng BO1- chủng có khả năng tạo khí H2 cao nhất trong các chủng đã phân lập, tiến hành nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh khí hydro của vi khuẩn trong thời gian từ 0 đến 72 giờ. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phát triển và sinh hydro của chủng ta có kết quả như sau (Bảng 3.8):
0 50 100 150 200 250 300 4 5 6 7 8 T h ể tí c h H 2 s in h r a ( m l/ L ) pH Nguồn vi sinh vật từbùn Nguồn vi sinh vật từphân bò
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh trưởng và sinh khí
Kết quả cho thấy q trình sinh trưởng và tạo khí đi liền với nhau, có nghĩa là khi tế bào tăng trưởng thì cũng sản sinh ra khí (Đặng Thị Yến và cs, 2016). Hình 3.5 cho thấy: theo thời gian ni cấy sinh khối tế bào tăng dần cùng với sản lượng hydro tăng theo. Tại thời điểm từ 0 – 6 giờ sinh khối tế bào tăng chậm OD từ 0,032- 0,094 và lượng khí hydro sinh ra ít đạt từ 0 – 10,83 ml/L mơi trường. Sau 12 giờ lượng khí bắt đầu tăng nhanh. Từ 12 – 36 giờ lượng khí sinh ra tăng từ 40,38- 365,13 ml/L mơi trường, sau đó tăng chậm hơn và đạt cực đại tại 48 giờ với sản lượng hydro thu được
Thời gian (h) Sản lượng Hydro (ml/L môi trường) OD 600 0 0 0,032 ± 0,0 6 10,83 ± 0,21 0,094 ± 0,019 12 40,38 ± 3,98 0,291 ± 0,022 18 141,02 ± 6,7 0,513 ± 0,025 24 245,25 ± 12,4 0,735 ± 0,035 30 286,57 ± 2,42 0,856 ± 0,015 36 365,13 ± 11,57 1,014 ± 0,042 42 452,94 ± 3,26 1,244 ± 0,049 48 581,63 ± 5,24 1,469 ± 0,028 54 447,72 ± 6,53 1,157 ± 0,014 60 344,29 ± 2,44 0,974 ± 0,058 66 274,55 ± 16,76 0,801 ± 0,029