PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp DNS.
▪ Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit
dinitrosalicylic DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với nồng độ đường khử trong phạm vi nhất định. Dựa trên đồ thị đường chuẩn đối với glucoza tinh khiết tính được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích.
▪ Dụng cụ: Máy so màu, 10 ống nghiệm loại 20ml, 10 ống nghiệm loại 5ml, 1
bình định mức 100ml, máy đo độ ẩm, cuvet, giấy lọc.
▪ Hóa chất:
- Axit dinitrosalicylic DNS
- Muối tactarat kép KNaC4H4O6.4H2O - NaOH dung dịch 2M
Cân 0,25g DNS và 75g KNaC4H4O6.4H2O trong 50 ml NaOH 2M (4g NaOH trong 50 ml nước cất) định mức tới 250 ml bằng nước cất, bảo quản trong bình nâu ở 4°C trong 2 tuần.
▪ Tiến hành:
- Dựng đường chuẩn glucoza: Cân glucoza tinh khiết 99% sấy 105°C tới khơ tuyệt đối rồi cân 1g phân tích hịa tan đường glucoza bằng nước cất và định mức tới 100 ml.
Nồng độ glucose chuẩn (mg/l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Số ml dung dịch glucose 1 g/l 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Số ml nước cất 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 Sau đó lấy 100 µl các nồng độ pha loãng trên vào ống nghiệm 5ml (hoặc eppendorf) thêm 1000 µl DNS lắc kỹ, đun cách thủy 10 phút làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phịng (100 µl nước cất + 1000 µl DNS làm mẫu trắng chỉnh máy so màu về 0) rồi đo trên máy so mầu với bước sóng 570 nm.
Vẽ đồ thị chuẩn với trục tung là OD, trục hoành là nồng độ đường (mg/ml)
▪ Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu:
Pha loãng mẫu sao cho hàm lượng đường khử trong khoảng 0,12- 0,42 mg/ml rồi tiến hành đo xác định như trong phần dùng đồ thị chuẩn.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn đã dựng, tra được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích.
Chú ý: Màu của hỗn hợp chỉ tạo ra trong môi trường kiềm, do vậy những mẫu
axit phải được trung hịa trước khi đem phân tích. Các mẫu đã được đun có thể để được một thời gian (20 phút) trước khi đo. Các mẫu không đun sẽ bị phân hủy dần dần.