Bảng 3 .1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn lactic
Bảng 3.3 Thành phần môi trường khảo sát nhân giống cấp 2
Thành phần môi trường nhân giống cấp 2 Tên môi trường
RYG RYP RYGP MRS
Dịch gạo lứt thủy phân (°Bx) 1 1 1 -
Glucose (g/l) 10 - 10 20 Cao nấm men (g/l) 10 10 10 5 Peptone (g/l) - 2 2 10 Cao thịt (g/l) - - - 10 Triamonium citrate (g/l) - - - 2 K2HPO4(g/l) 2 2 2 2 CH3COONa (g/l) - - - 5 Tween 80 (g/l) 1 1 1 1 MgSO4(g/l) 0,2 0,2 0,2 0,2 MnSO4 (g/l) - - - 0,05 pH 6,0 6,0 6,0 6,0
Hình 3.6. Khả năng sinh trưởng của chủng trên các môi trường nhân giống khác nhau
Từ kết quả Hình 3.6 cho thấy, các mơi trường nhân giống MRS và RYGP cho kết quả tương đương nhau và cao nhất trong các môi trường. Nhằm tạo điều kiện
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 2 4 6 8 10 12 14
MRS (1) RYG (2) RYP (3) RYGP (4)
g/l
Mật độ tế bào (x10^8) Kefiran g/l
thuận lợi nhất cho quá trình lên men, cũng như việc tạo điều kiện cho chủng giống thích ứng với mơi trường lên men, mơi trường RYGP được sử dụng cho quá trình nhân giống cấp 2.
3.3.2.2. Khảo sát thời gian và nhiệt độ nhân giống
Sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật trong quá trình lên men được diễn ra theo một chu kỳ nhất định. Giai đoạn đầu của q trình lên men là sự thích nghi của các chủng vi sinh vật trong môi trường. Thời gian càng kéo dài hàm lượng sinh khối vi sinh vật càng tăng. Tuy nhiên sau một thời gian lên men nhất định, khi lượng cơ chất trong môi trường dần cạn kiệt, tế bào vi sinh vật bị phân rã do tác động của enzyme trong canh trường là nguyên nhân khiến hàm lượng sinh khối bị giảm. Vì vậy, để thu được hàm lượng sinh khối lớn nhất cần xác định được thời gian lên men hiệu quả.
Trong quá trình lên men với quy mơ lớn, việc chia q trình nhân giống thành nhiều cấp sẽ đảm bảo cho tỉ lệ giống được ổn định. Nếu nhân giống một lần thì lượng giống khởi đầu là rất lớn, hoặc nếu chia quá trình nhân giống thành quá nhiều cấp sẽ dẫn đến già giống, khơng đảm bảo cho q trình sinh trưởng của giống khi tiến hành lên men. Vì vậy, tùy thuộc vào quy mô lên men mà tiến hành chia việc nhân giống thành các cấp cho phù hợp.
Chất lượng giống ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, vì vậy các quá trình nhân giống cần được thực hiện trong các điều kiện thích hợp nhất. Thời gian và nhiệt độ trong q trình nhân giống có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng giống. Nếu nhiệt độ nhân giống khơng thích hợp với chủng giống thì q trình phát triển sinh khối của giống không tốt, không đảm bảo mật độ giống ban đầu cho quá trình lên men. Về thời gian nhân giống, nếu thời gian nhân giống không được tối ưu, quá ngắn hoặc quá dài, sẽ dẫn đến mật độ giống không đảm bảo hoặc giống quá già, khơng đảm bảo cho q trình lên men sau này. Vì vậy, quá trình khảo sát được thực hiện trên dải nhiệt độ từ 25°C- 38°C, thời gian khảo sát đến 28 giờ. Kết quả của quá trình khảo sát được thể hiện trong Hình 3.7.
Hình 3.7. Khảo sát nhiệt độ và thời gian nhân giống trên môi trường RYGP của chủng
Dựa vào kết quả Hình 3.7, điều kiện nhân giống thích hợp nhất là trong khoảng từ 30°C - 32°C trong khoảng thời gian 22 giờ. Tại điều kiện này, mật độ giống là tốt nhất đạt 15,98 ×108 tế bào/ml, hàm lượng kefian được sinh ra trong thời gian này cũng là cao nhất.
3.3.2.3. Khảo sát mật độ giống bổ sung vào môi trường lên men
Tỉ lệ giống bổ sung cho quá trình lên men cũng là một trong các yếu tố ảnh hưởng lớn tới quá trình lên men. Nếu lượng giống bổ sung thấp, thời gian lên men sẽ bị kéo dài, ảnh hưởng tới hiệu quả kinh tế, nếu lượng giống bổ sung ban đầu quá nhiều, tỉ lệ dinh dưỡng trong môi trường so với mật độ giống thấp, dẫn tới cạnh tranh dinh dưỡng sẽ xảy trong quá trình lên men. Điều này cũng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình lên men, ngoài ra sẽ tốn một lượng giống nhiều hơn mức bình thường. Vì vậy, việc khảo sát lượng giống bổ sung ban đầu là cần thiết. Môi trường lên men cơ bản được sử lý trước khi tiến hành lên men. Mật độ giống được khảo sát từ 2% - 10%. Môi trường lên men được đặt trong điều kiện là 32oC. Tiến hành khảo sát trong khoảng thời gian là 24 giờ, xác định các thông số về mật độ tế bào, lượng kefiran sinh ra. Kết quả của quá trình thể hiện trong Hình 3.8.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 8 12 16 18 20 21 22 23 24 M ật đ ộ tế b ào ( 10 8 tế b ào/m l)
Thời gian ni cấy (giờ)
25°C 28°C 30°C 32°C 35°C 38°C
Hình 3.8. Khảo sát tỉ lệ tiếp giống vào môi trường lên men
Kết quả Hình 3.8 cho thấy, với tỉ lệ giống bổ sung là 2% mật độ giống không cao bằng các nồng độ khảo sát khác, thời gian giống phát triển đến cực điểm cũng bị kéo dài. Trong khi đó, với các nồng độ giống bổ sung là 8% và 10% ban đầu có sự phát triển nhanh nhưng cũng nhanh chóng đi vào pha cân bằng và suy giảm mật độ sau đó. Tỉ lệ giống bổ sung là 6% cho kết quả tốt nhất. Mật độ tế bào là cao nhất tại thời điểm 22 giờ kể từ thời điểm bổ sung giống. Hàm lượng kefiran sinh ra trong quá trình nhân giống cũng là cao nhất đạt 0,636 g/l.
3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp kefiran của chủng lựa chọn
Để tạo điều kiện tối ưu cho quá trình lên men việc bổ sung chất dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic là rất cần thiết. Mặc dù trong môi trường dịch gạo lứt thủy phân đã chứa một lượng lớn chất dinh dưỡng, tuy nhiên để đạt hiệu quả cao trong lên men, cần thiết phải lựa chọn khoảng nồng độ thích hợp các chất thiết yếu cho quá trình sinh tổng hợp kefiran như: đường saccharose, cao nấm men, và các muối khoáng KH2PO4, (NH4)2HPO4, …
3.3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch gạo thủy phân
Dịch gạo lứt sau khi thủy phân sẽ là nguồn cung cấp dưỡng chất chính cho vi khuẩn lactic trong quá trình lên men. Vì vậy, quá trình khảo sát nồng độ dịch gạo
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 8 12 16 18 20 21 22 23 24 M ật độ t ế bà o (1 0 8 tế bà o/m l)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
2% 4% 6% 8% 10% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 8 12 16 18 20 21 22 23 24 K ef ira n (g /l)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
2% 4% 6% 8% 10%
lứt thủy phân là cần thiết để nâng cao hiệu suất lên men cũng như hiệu quả kinh tế cho cả quá trình lên men. Dịch gạo lứt sau thủy phân được pha loãng và đưa về các nồng độ khác nhau 5°Bx, 10°Bx, 15°Bx, 20°Bx, 25°Bx. Lượng giống bổ sung là 6%, môi trường được nuôi ở nhiệt độ là 30°C trong 48 giờ. Tiến hành xác định hàm lượng kefiran để lựa chọn được nồng độ dịch gạo lứt thủy phân thích hợp. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.9.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ dịch gạo thủy phân đến hàm lượng kefiran tạo thành
Kết quả Hình 3.9 cho thấy, lượng kefiran sinh ra thấp nhất trên mơi trường có lượng dịch gạo lứt thủy phân là 5°Bx, sau đó tăng dần. Tại các mơi trường có nồng độ chất khô đạt 15, 20, 25°Bx, cho lượng kefiran tương đương nhau và cao nhất trong các tỉ lệ khảo sát (đạt 2,09 - 2,11 g/l). Sự chênh lệch hàm lượng kefiran sinh ra trong các mơi trường có nồng độ chất khơ từ 15 - 25°Bx là khơng đáng kể. Vì vậy để tiết kiệm chi phí, lượng dịch gạo thủy phân cho q trình lên men, mơi trường dịch gạo lứt chứa hàm lượng chất khô là 15°Bx được chọn cho các quá trình khảo sát và lên men tiếp theo.
3.3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose bổ sung
0 0.5 1 1.5 2 2.5 5 10 15 20 25 K ef ir an (g /l)
Nồng độ dịch gạo lứt thủy phân (°Bx)
Trong thành tế bào Trong dịch lên men
Việc bổ sung saccharose nhằm bổ sung nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn trong quá trình lên men nhằm tăng hiệu suất q trình. Mơi trường dịch gạo lứt thủy phân (nồng độ chất khơ 15°Bx) được sử dụng cho q trình khảo sát. Hàm lượng đường bổ sung trong quá trình khảo sát lần lượt là 0, 5, 10, 15, 20, 25 g/l. Tiến hành lên men ở 30°C trong 48 giờ. Sau quá trình lên men, tiến hành xác định hàm lượng kefiran. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.10.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose bổ sung đến hàm lượng kefiran tạo thành
Kết quả trên cho thấy, việc bổ sung đường saccharose làm tăng khả năng phát triển và sinh kefiran của chủng lactic. Hàm lượng kefiran tăng dần khi hàm lượng đường bổ sung tăng từ 0 - 10 g/l. Sau đó hàm lượng kefiran sinh ra có sự ổn định khi lượng đường bổ sung tăng dần từ 10 đến 25 g/l. Như vậy, lượng đường saccharose bổ sung thích hợp nhất cho quá trình lên men là 10 g/l, khi đó lượng kefiran sinh ra cũng là cao nhất đạt 2,51 g/l sau 48 giờ lên men.
3.3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men bổ sung
Cao nấm men cũng là một trong các dưỡng chất quan trọng của các chủng vi khuẩn lactic. Việc bổ sung cao nấm men sẽ giúp bổ sung nguồn dinh dưỡng thiếu hụt từ môi trường dịch gạo lứt thủy phân. Nồng độ cao nấm men bổ sung trong thí nghiệm lần lượt là 0, 1, 2, 3, 4, 5 g/l. Môi trường sau khi thanh trùng được đưa về
1 1.5 2 2.5 3 0 5 10 15 20 25 K ef ir an (g /l) Saccharose (g/l) Trong thành tế bào Trong dịch lên men
nhiệt độ 30oC và bổ sung giống. Quá trình lên men được thực hiện trong 48 giờ tại nhiệt độ 30oC. Sau quá trình lên men, tiến hành phân tích hàm lượng kefiran trong dịch và tế bào. Kết quả phân tích được thể hiện qua Hình 3.11.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men bổ sung đến hàm lượng kefiran tạo thành
Từ kết quả tại Hình 3.11 cho thấy, việc bổ sung cao nấm men giúp khả năng tạo kefiran của chủng giống tăng lên. Cụ thể, hàm lượng kefiran sinh ra tăng dần khi lượng cao nấm men bổ sung tăng dần từ 0 đến 2 g/l. Khi hàm lượng cao nấm men bổ sung tăng từ 2 g/l trở lên, hàm lượng kefiran sinh ra có sự ổn định, sự chênh lệch giữa các thí nghiệm là khơng đáng kể trong thời gian khảo sát. Như vậy có thể kết luận rằng hàm lượng cao nấm men bổ sung thích hợp nhất cho q trình lên men là 2 g/l.
3.3.3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung chất khoáng
Trong gạo lứt có hàm lượng các chất khống khá cao, nhưng việc khảo sát bổ sung chất khống trong q trình lên men là cần thiết nhằm tạo điều kiện tối ưu nhất cho quá trình lên men. Một số khoáng chất cần thiết cho quá trình lên men như KH2PO4, MgSO4, (NH4)2HPO4, sẽ được bổ sung theo các tỉ lệ lần lượt là KH2PO4 0,5%, MgSO4 0,01%, (NH4)2SO4 0,5%. Đối chứng kết quả khảo sát với môi trường
1 1.5 2 2.5 3 0 1 2 3 4 5 K ef iran (g/l ) Cao nấm men (g/l)
lên men khơng được bổ sung khống. Kết quả khảo sát được thể hiện qua Hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của việc bổ sung chất khoáng đến hàm lượng kefiran tạo thành
Từ kết quả trên cho thấy, khơng có sự khác biệt về hàm lượng kefiran sinh ra trong quá trình lên men giữa việc bổ sung khống và khơng bổ sung khống. Như vậy, việc khơng bổ sung khống khơng ảnh hưởng đến q trình lên men của chủng giống.
3.3.4. Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp kefiran
3.3.4.1. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Độ pH ban đầu có ảnh hưởng rất lớn tới tốc độ phát triển của vi khuẩn lactic trong q trình lên men. Mơi trường lên men có pH ban đầu phù hợp với chủng vi sinh vật sẽ làm giảm thời gian thích nghi của chủng giống với mơi trường. Ngược lại, nếu mơi trường ban đầu có pH khơng phù hợp sẽ làm tăng thời gian thích nghi, thậm chí làm giảm khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật. Vì vậy, việc khảo sát độ pH ban đầu trong môi trường lên men là cần thiết. Khoảng pH từ 5,0 đến 7,5 được sử dụng để đánh giá mức độ ảnh hưởng của pH tới sự hình thành sinh khối của chủng nghiên cứu. pH trong môi trường được điều chỉnh bằng axit lactic.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Lần 1 Lần 2 Lần 3 K ef ir an g/l Lần thí nghiệm Bổ sung Khơng bổ sung
Sau khi tiến hành thí nghiệm, tiến hành phân tích hàm lượng kefiran sinh ra. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.13.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH ban đầu môi trường lên men đến hàm lượng kefiran tạo thành
Từ kết quả thể hiện tại Hình 3.13 cho thấy, tại các mơi trường có pH ban đầu khác nhau cho lượng kefiran sinh ra khác nhau sau quá trình lên men. Hàm lượng kefiran tổng tăng dần khi pH ban đầu tăng từ 5 đến 6. Khi pH ban đầu lớn hơn 6, hàm lượng kefiran sinh ra giảm dần. Như vậy, lượng kefiran sinh ra đạt cao nhất tạo pH ban đầu của môi trường là 6,0 đạt 3,65 g/l sau 48 giờ lên men.
3.3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men
Nhiệt độ lên men là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu suất của quá trình lên men. Khi nhiệt độ khơng thích hợp q trình lên men bị kéo dài, quá trình sinh trưởng của vi sinh vật cũng bị ảnh hưởng rất lớn, đặc biệt là tốc độ phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, việc khảo sát nhiệt độ của quá trình lên men là rất cần thiết. Môi trường lên men sau khi được bổ sung giống vi khuẩn sẽ được đưa về các nhiệt độ khác nhau và thực hiện lên men trong khoảng thời gian là 48 giờ. Các nhiệt độ môi trường khảo sát là 25°C, 27°C, 30°C, 32°C, 35°C, 37°C và 40°C. Kết quả phân tích được thể hiện tại Hình 3.14.
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 5 5.5 6 6.5 7 7.5 K ef iran (g/l ) pH ban đầu
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng kefiran tạo thành
Kết quả tại Hình 3.14 cho thấy, tại các nhiệt độ lên men khác nhau lượng kefiran sinh ra cũng có sự khác nhau. Hàm lượng kefiran sinh ra trong môi trường dịch gạo lứt thủy phân tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 25 đến 32°C, sau đó giảm dần khi nhiệt độ tiếp tục tăng. Tại các điểm nhiệt độ khảo sát là 30°C và 32°C, hàm lượng kefiran sinh ra có sự chênh lệch không đáng kể. Như vậy, thông qua kết quả thí nghiệm, lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho q trình lên men là từ 30 đến 32°C, lượng kefiran sinh ra cao nhất đạt 3,57 g/l.
3.3.4.3. Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp kefiran của chủng
Để thu được hàm lượng kefiran lớn nhất trong q trình lên men, ngồi việc đảm bảo về nguồn dinh dưỡng, nhiệt độ lên men, thời gian lên men cũng cần được chú ý đến. Việc thời gian lên men ngắn sẽ không đảm bảo việc phát triển, sinh kefiran của chủng lactic, còn thời gian lên men dài sẽ làm giảm mật độ tế bào về sau do môi trường hết dinh dưỡng, tế bào già dẫn đến chết, hiệu quả kinh tế giảm do kéo dài quá trình lên men.
Tiến hành theo dõi khả năng sinh tổng hợp kefiran của chủng trong 5 ngày nuôi cấy trong môi trường dịch gạo lứt thủy phân ở 32°C. Xác định hàm lượng kefiran sinh ra theo thời gian nuôi cấy trong dịch lên men và trong tế bào. Kết quả tính tốn