chă ̣t chẽ, do đó ta có thể sƣ̉ du ̣ng phƣơng trình y = 0,0088x – 8,5536 để tính đƣợc LD50 =1540mg/kg.
Nhƣ vậy ta có thể đi đến kết luâ ̣n:
LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg
2.3.3.Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC-MS)
STT Liều dùng
(mg/kg) Số chuô ̣t/lô Số chuô ̣t chết Tỷ lệ %
1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100 Liều dùng(mg/kg) Số chuô ̣t chết
Xây dựng đƣờng chuẩn metformine hydrochloride: Cân 2mg
metformin hydrochloride chuẩn đƣợc pha loãng trong MeOH với các nồng độ nhƣ sau: 2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.2mg/ml, 0.1mg/ml.
Điều kiện và thiết bị phân tích: Sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent
1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O:MeOH= 35:65. Hệ Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:
Xây dựng đƣờng chuẩn: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần
mềm excel.
Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min)
0,00 65 0,01
4,00 65 0,01
5,00 65 0,3
30 65 0,3
Nồng Đợ(mg/ml) Diện tích Pic 2 5393,66 0,4 1027,07 0,2 515,55 0,1 19,.97
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2000 4000 6000 Dtich n o n g d o (m g /m l) nongdo(mg/ml) Predicted nongdo(mg/ml) Phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y= 0.000372*X
Trong đó: Y là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); X là diện tích pic metformin hydrochloride .
Xác định nồng độ Metformine hydrochloride: Cân 0.8mg chất cần phân tích, hịa tan trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (X)= 2115,1. Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0.8mg/ml.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tổng hợp Glibenclamid.
Cho axit 5-chloro-2- methoxybenzoic (1) phản ứng với SOCl2 trong sự có mặt của dung môi CHCl3 ở 250C, trong khoảng 8h nhận đƣợc 5-chloro-2- methoxybenzoyl chloride (2) với hiệu suất 85,71%. Chất trung gian (2) đƣợc ngƣng tụ với 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamit (3) trong môi trƣờng pyridin ở nhiệt độ 600C trong khoảng 8h tạo thành (4) với hiệu suất 90%. Chất trung gian (4) cho tác dụng với cyclohexyl isocyanat trong môi trƣờng kiềm Na2CO3 dung môi aceton, ở 250C trong khoảng 36h tạo thành hợp chất
5 với hiệu suất đạt đƣợc 82,11%.( Sơ đồ 3.1).
Sơ đồ 3.1. Tổng hợp glibenclamide.
Nhƣ vậy, glibenclamit đã đƣợc nghiên cứu tổng hợp qua ba bƣớc phản ứng từ axit 5-chloro-2-methoxybenzoic. Tất cả các bƣớc phản ứng đều đạt hiệu suất cao. Sản phẩm đạt tiêu chuẩn Châu Âu 2002.
Cấu trúc của sản phẩm đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR, phổ khới lƣợng EI-MS.
Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của chất trung gian (4).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 4 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu đặc trƣng cho đợ chuyển dịch hóa học của các proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu ở δH 8,25 ppm (1H, m,) đặc trƣng cho proton nhóm NH, tín hiệu δH 7,28 ppm (2H, bs,) đặc trƣng cho proton nhóm NH2;, tín hiêu δH 3,81ppm (3H, s, OMe) đặc trƣng cho proton nhóm OMe. Trong phổ 1H- NMR của chất này cịn xuất hiện các tín hiệu của proton H-9, H-10, H-12, H- 13, H-14, H-15, H-18, H-20, H-21 tại δH 7,76 (2H, d, J=8,5Hz, H-9 và H-13); 7,64 (1H, d, J=3Hz, H-18); 7,51-7,48 (1H, dd, J=3Hz và 9Hz, H-20); 7,45 (2H, d, J=8,5Hz, H-10 và 12); 7,16 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,55-3,51 (2H, m, H-15); 2,93-2,90 (2H, m, H-14)
Hình 3.2: : Phổ 13C-NMR của chất trung gian (4)
Phổ 13C-NMR của chất trung gian 4 khẳng định sự có mặt của 16
nguyên tử cacbon bao gồm hai nhóm cacbonyl CO tại δC (ppm) 163,56 (C-9) và 155,65 (C-15); 143); nguyên tử cacbon bậc 4 chƣa no tại δC 143,58 (C-4); 142,09 (C-1);6 nhóm metin olefinic ( =CH) tại δC 131,45 (C-13) ; 129,45 (C- 11); 129,12(C-3 và 5); 125,65 (C-2 và 6); 1 nhóm halogen ( C-Cl) tại δC 124,79 (C-12); 1 nhóm metoxi tại δC 56,23 (OMe); 2 nhóm metylen (CH2) tại δC 54,83 (C-8); 34,55 (C-7).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử 4 ở m/z 368 [M +H]+ (C16H17ClN2O4S ).
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất glibenclamide (5).
Phổ 1H-NMR của 5 cho các tín hiệu cợng hƣởng từ proton ở δH (ppm) 7,93 (2H, d, J=8,5Hz, H-9 và 13); 7,83 (1H, s, H-18); 7,52 (2H, d, J=8Hz, H- 10 và 12); 7,47 (1H, d, J=9Hz, H-20); 7,11 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,85 (3H, s, OMe); 3,73-3,70 (2H, m, H-15); 3,43-3,42 (1H, m, H-1); 3,066-3,038 (2H, t, J=7Hz, H-14); 1,78-1,17 (10H, m, H-1, 2, 3, 4, 5, 6 vùng no).
Hình 3.4: : Phổ 13C-NMR của chất glibencalmide (5) .
Phổ 13C -NMR của glibenclamide khẳng định sự có mặt của 23 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm cacbonyl CO tại δC (ppm) 166,6 (C-7); 159,9 (C- 16); nguyên tử cacbon bậc 4 chƣa no tại δC 144,1 (C-11); 133,4 (C-8); 6 nhóm metin olefinic ( =CH) tại δC 131,5 (C-20); 129,9 (C-10 và 12); 128,1 (C-9, 13 và 18); 1 nhóm halogen ( C-Cl) tại δC 127,1 (C-19); 1 nhóm metoxi tại δC 57,1 (OCH3); 2 nhóm –CN tại δC 41,8 (C-1) và 36,0 (C-15); 5 nhóm metylen ( CH2) tại δC 34,7 (C-4); 26,7 (C-2);26,7 (C-6); 26 (C-3) và 25,9 (C-5).
Hình 3.5: Phổ EI-MS của glibenclamide (5).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 495 [M +H]+ (C23H28ClN3O5S).
3.2. Tổng hợp metformine hydrochloride.
Tổng hợp metformine hydrochloride theo phƣơng pháp của Shapiro [3] (sơ đồ 3.2) trong điều kiện không dung môi. Từ 1 mol dicyano diamide và 1 mol dimethyl amine hydrochloride trộn lẫn với nhau đƣợc đun ở nhiệt độ: 140oC trong 6h. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc kết tinh trong dung môi metanol nhận đƣợc metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%.
Sơ đồ 3.2: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride