Trên phổ 13C-NMR xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cợng hƣởng của 4 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm metyl ( CH3) tại δC (ppm) 37,4 ( C-1 và C-1‟ ); 2 nhóm amin C-NH2 tại δC (ppm) 160,0 (C-3), và 158,3 (C-2).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 129 [M- HCl]+ (C4H11N5.HCl).
3.2.1. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride
Metformine hydrochloride đƣợc làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
Sản phẩm thô metformine hydrochloride (50g) lần lƣợt đƣợc hoàn tan trong các dung mơi nóng aceton, MeOH và EtOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc kết tinh trong tủ lạnh 24h, lọc bỏ dung môi, hút khô nhận đƣợc tinh thể
metformine hydrochloride màu trắng với hiệu suất kết tinh trong aceton là 30%, trong MeOH là 82% và trong EtOH là 48%. Nhƣ vậy, metformine hydrochloride đƣợc kết tinh trong dung môi MeOH cho hiệu suất kết tinh đạt 82% và độ tinh khiết khoảng 99,8%.
3.2.2. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride
Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Kết quả nghiê n cƣ́u cho thấy sau khi uống thuốc , ở những lô dùng thuốc với liều thấp dƣới 900mg/kg thể trọng, chuô ̣t có giảm hoa ̣t đô ̣ng, run nhƣng sau khoảng 30 phút lại ăn uống và hoạt đợng bình thƣờng , đi ngoài phân khơ . Ở những lô chuột uống thuốc thƣ̉ liều cao, chuô ̣t giảm vâ ̣n đô ̣ng , run rõ rê ̣t , tai và đuôi tím tái , phân nhão. Tƣ̀ liều 1100mg/kg trở lên có chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.1
Bảng 3.1:Bảng kết quả thử đợc tính cấp của metformin hydrochloride
Từ bảng kết quả , xây dƣ̣ng đƣợc đồ thi ̣ về mối tƣơng quan giƣ̃a liều dùng và số chuột chết nhƣ sau:
LST
T Liều dùng (mg/kg) Số chuô ̣t/lô Số chuô ̣t chết Tỷ lệ %
1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100
Hình 3.8: Đồ thị về mối tƣơng quan giữa liều dung và số chuột chết
Với R2 = 0,9776 đã cho thấy hai đa ̣i l ƣợng này có mới tƣơng quan tuyến tính, do đó ta có thể sƣ̉ du ̣ng phƣơng trình y = 0,0088x – 8,5536 để tính đƣợc LD50 = 1540mg/kg.
Nhƣ vật,đợc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg
3.2.3. Hàm lƣợng metformin hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC
Định lƣợng metformin hydrochloride bằng HPLC sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha đợng H2O: MeOH= 35:65. Hệ Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:
Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min)
0,00 65 0,01
4,00 65 0,01
5,00 65 0,3
30 65 0,3
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm excel nhƣ chỉ ra ở hình sau đây.
Liều (mg/kg) Số
chuô ̣t chết
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2000 4000 6000 Dtich n o n g d o (m g /m l) nongdo(mg/ml) Predicted nongdo(mg/ml) Phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y= 0.000372*X
Trong đó: Y là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); X là diện tích pic metformin hydrochloride (mg/ml).
Xác định nồng độ Metformin: Cân 0,8mg chất cần phân tích, hịa tan trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (X)= 2115,1(mg/ml).Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0,8mg/ml. Nhƣ vậy, mẫu phân tích chứa 100% metformin hydrochloride.