CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.3. THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC LOÀ
1.3.1. Thành phần hóa học của lồi đỉnh tùng Cephalotaxusharringtonia
Năm 1972, nhóm nghiên cứu của Powell cơng bố 5 alkaloid: cephalotaxine (1) và các ester của nó là harringtonine (2), isoharringtonine (3), homoharringtonine (4) và deoxyharringtonine (5) từ hạt của loài đỉnh tùng Cephalotaxus harringtonia K. Koch var. harringtonia cv.Trong đó 1 là chất khơng có hoạt tính sinh học, nhưng
các ester của nó là 2, 3, 4 và 5 là những chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả
Các chất 2 và 4 đã được phát triển như là thuốc trong điều trị bệnh ung thư ở Trung Quốc như bệnh bạch cầu cấp tính nonlymphoid và bệnh bạch cầu hạt mạn tính.
Hợp chất 3 cũng được xem là hợp chất có khả năng kháng ung thư. Khả năng gây độc tế bào của 3 cũng được kiểm tra với tế bào bạch cầu ở người HL-60. Kết quả cho thấy với giá trị IC50 = 10-7 mol/l, thì tỉ lệ apoptosis có thể đạt 43,8% khi điều trị tế bào HL-60 trong 120 phút. Các chất 2, 4 và 5 cũng được thử hoạt tính
kháng tế bào ung thư bạch cầu ở chuột (P-388) và ở người (lymphoid L1210), chúng có hoạt tính mạnh nhất khi sử dụng với liều lượng 1-2 mg/kg.
Homoharringtonine (4), có tên thương mại là Synribo,là chất rắn dạng bột màu trắng, tan một phần trong nước, tan nhiều trong DMSO, chloroform, ethanol, methanol. Chất 4 được FDA (Food & Drug Administration) chấp nhận trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào tủy mạn tính đối với bệnh nhân là người lớn. Chất này có hoạt tính sinh học mạnh, kháng tế bào ung thư người: KB (IC50 = 4 nM), tế bào A549 (IC50 = 30 nM), hay tế bào chuột P-388(IC50 = 31, 16 nM). Ngoài ra chất 4 chống lại các tế bào KB-VIN nhân kháng thuốc với giá trị IC50 = 0,51 mM.
Homoharringtonine có khả năng gây ức chế sự tổng hợp protein khi dùng liều lượng phù hợp bằng cách tác động lên các ribosome của các tế bào ung thư và ngăn chặn sự tiến triển của các tế bào. Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng homoharringtonine có hiệu quả trong điều trị bệnh bạch cầu dịng tủy cấp tính (AML), bệnh bạch cầu myeloid mạn tính (CML) và hội chứng myelodysplastic.
Năm 1996, các nhà hóa học Nhật Bản cơng bố kết quả thu được khi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc các alkaloid từ dịch chiết methanol của lá và thân loài đỉnh tùng Cephalotaxusharringtonia var. drupacea. [10], [11], [12]. Các
alkaloid gồm: (6) 5’-des-O-methylharringtonine (7) 3’S-hydroxyl-5’-des-O-methylharringtonine (8) 5’-des-O-methylhomoharringtonine (9) 5’-des-O-methylisoharringtonine (10) Cephalotaxidine (11) Neoharringtonine (12) Homoneoharringtonine (13) 3’S-hydroxyneoharringtonine
Hình 1.18: Cấu trúc hóa học của các alkaloid
Các đánh giá về hoạt tính sinh học của các alkaloid cephalotaxidine (10), neoharringtonine (11), homoneoharringtonine (12), và 3’-(S)- hydroxyneoharringtonine (13) trên tế bào bạch cầu ở chuột P-388 cho thấy cả 4 chất này đều có khả năng chống lại tế bào ung thư với các nồng độ gây độc tế bào IC50 tương ứng là 1,8 μg/ ml (10); 0,012 μg/ ml (11);0,28 μg/ ml (12) và 0,19 μg/ ml (13). Đáng chú ý là hoạt tính kháng tế bào ung thư của hợp chất 11 mạnh gấp 10 lần hợp chất 12 và 13.
1.3.2. Thành phần hóa học của lồi đỉnh tùng Cephalotaxus Wilsoniana
Năm 1972, các nhà khoa học R. G. Powell và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc của 4 alkaloid từ dịch chiết ethanol của cành và lá loài đỉnh tùng
Cephalotaxuswilsoniana Hayata, trong đó có Cephalotaxine cùng với 3 hợp chất
Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Yao-Haur Kuođã tách từ dịch chiết ethanol của Cephalotaxus wilsoniana được các chất: taiwanhomoflavone-B (17); 7,4’,7”-tri- O-methylamentoflavone (18); 6-C-methylnaringenin (19) và apigenin-7-O-β- glucoside (20). Taiwanhomoflavone-B là chất gây độc tế bào với giá trị ED50 có giá trị lần lượt là 3,8 và 3,5 µg/ml, có khả năng chống lại ung thư biểu mơ KB và tế bào gan Hepa-3B. [32]
20. Apigenin-7-O-β-glucoside
Chất 17 và 20, hainanolide, epi- wilsonine, sugiol và isopimaric acid được
kiểm tra trên các dòng tế bào ung thư: KB, COLO-205, Hepa-3B và Hela. Các dữ liệu chỉ ra rằng sugiol và isopimaric là các chất hoạt động, các chất còn lại cho thấy khả năng gây độc tế bào. Đặc biệt hainanolide là chất có hoạt tính mạnh nhất, có khả năng kháng lại 4 dịng ung thư nói trên và đang được nghiên cứu khả năng kháng lại các dòng tế bào ung thư khác.
Năm 2004, Li-Wen Wang và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu về loài đỉnh tùng Cephalotaxus wilsoniana. Các hợp chất C-3-epi-wilsonione (15),
taiwanhomoflavone C (21), và một đồng phân của desmethylcephalotaxinone (22) đã được phân lập. Cấu trúc của các chất này được xác định bằng các phương pháp phổ. Trong đó chất 15 có khả năng chống lại tế bào ung thư người: Hep G2, MCF- 7, Hep 3B, HT-29 với giá trị IC50 lần lượt là 52,0; 42,0; 52,0 và 24,4 µg/ml.
1.3.3. Thành phần hóa học của lồi đỉnh tùng Cephalotaxus mannii
Năm 1979, khi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học lồi đỉnh tùng
Cephalotaxus mannii trồng ở Ấn Độ, Richard G. Powell tách được từ dịch chiết
chloroform của thân và rễ của cây này 3 hợp chất: cephalomannine (23), baccatin III (24) và taxol (25) [20].
Trong hầu hết các loài thuộc chi Cephalotaxus đã được nghiên cứu thì chủ yếu tìm thấy các alkaloid thuộc kiểu harringtonine, nhưng cephalomannine là một alkaloid mới khơng thuộc kiểu đó, nó là chất gây độc tế bào KB với giá trị LD50 = 3,8 x10-3 μg/ml và gây ức chế mạnh đối với tế bào bạch cầu PS ở chuột.
Năm 1979, Susan Howids ở trường y Albert-Einstein đã khám phá thấy taxol có nhiều đặc tính q như khả năng gây độc tế bào bằng cách liên kết với vi ống tubulin trong tế bào làm cho tế bào mất khả năng phân chia dẫn đến gây chết tế bào theo chu trình. Đặc tính mới này đưa taxol là một trong những thuốc chống ung thư đặc hiệu với các bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư Kaposi,…Ngồi ra, taxol cịn có khả năng chống bám dính và chống tái hẹp nên nó cịn được dùng che phủ bên ngồi của stent động mạch để chống tái hẹp động mạch vành.
1.3.4. Các loại tinh dầu trong một số loài đỉnh tùng [27]
Năm 2005 ba nhà hóa học là Wojciech Cisowski, Irena Mazol và Michal Glensk tiến hành khảo sát các loại tinh dầu có trong lá của 3 loài đỉnh tùng là:
Cephalotaxus sinensis, Cephalotaxusharringtonia var. drupacea, Cephalotaxus
fortunei bằng phương pháp sắc ký ghép nối khối phổ (GC-MS). Kết quả đã phát
hiện trong lá của ba lồi này có chứa 47 hợp chất, trong đó hai hợp chất chiếm tỉ lệ cao là: α-pinene (18,4% -35,1%) ; β-caryophyllene(khoảng 22%); delta-carene (khoảng 11%). Ngoài ra một số hợp chất khác như β-elemene, α-humulene, α- selinene, β- selinene,sabinene, camphene, α – cadinol,…chiếm tỉ lệ thấp hơn 10%, và một số hợp chất như: phytol, octacosane, 4-terpineol, γ-terpinene,….tồn tại dạng vết.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 2.1. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy IMPACT- 410, Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 [499,84 MHz (1H-) và 125 MHz (13C-); TMS (δ = 0,0); CD3OD (δ = 49,0); CDCl3
(δ = 77,0)] tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ việt Nam
Phổ khối ESI-MS và phổ khối phân giải cao (HR-MS) được đo trên máy Agilent LC -MSD-Trap SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam,
Điểm chảy được thực hiện trên thiết bị đo điểm chảy VEB Analytik Dresden HMK 73/4470 (Đức) tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Sắc ký lớp mỏng phân tích: Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60F254, có độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột thường: silica gel cỡ hạt 197 – 400 mesh
(0,040 – 0,063 mm) cho cột đầu. Sắc ký cột nhanh: silica gel cỡ hạt 70 – 200 mesh cho cột tiếp theo. Sắc ký cột pha đảo: RP-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 Merck. Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như
n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp ngâm chiết mẫu 2.2.1. Phƣơng pháp ngâm chiết mẫu
Mẫu thực vật thường được chiết theo hai cách:
* Phƣơng pháp chiết tổng: Mẫu thực vật sấy khô và xay nhỏ được ngâm chiết với
dung môi phân cực như MeOH hay EtOAc ở nhiệt độ thường hoặc có thể chiết nóng ở nhiệt độ 50 o
C. Thực hiện chiết mẫu lặp lại từ 3 đến 4 lần. Dịch chiết thu được được cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không thu
phân lớp lần lượt với dung mơi có độ phân cực tăng dần: n–hexan, EtOAc và n-
butanol. Với mỗi loại dung môi cũng thực hiện chiết lặp lại từ 3 đến 4 lần. Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao: n–hexan;
EtOAc;BuOH ).
* Phƣơng pháp chiết phân đoạn: Mẫu thực vật sấy khô và xay nhỏ, được ngâm
chiết lần lượt với từng loại dung mơi có độ phân cực tăng dần như: n–hexan,
EtOAc và MeOH. Với mỗi loại dung môi được chiết lặp lại từ ba đến bốn lần. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng.
2.2.2. Phƣơng pháp tách chất và xác định cấu trúc
. ● Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao dịch chiết trong các dung môi khác nhau, được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung mơi thích hợp. Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silica gel. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18. Kiểm tra các phân đoạn và độ sạch của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi thích hợp.
● Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất
Cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện bằng các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều như 1
H–NMR, 13C–NMR, DEPT. Các loại phổ được đo tại phịng cấu trúc, Viện Hố học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phƣơng pháp thăm dị hoạt tính sinh học 2.2.3.1. Hoạt tính kháng oxi hóa
Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa
- Phương pháp kháng oxi hóa thơng qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)
Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., M.B., Elena, K và cộng sự (2003). Dựa theo nguyên tắc chất 1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl (DPPH)
có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm.
Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging Capacity)
Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xữ lí số liệu Exel theo cơng thức:
SC%= [ 100 – TN MT AT OD OD OD x 100] ODTN: OD thí nghiệm ODMT: Mẫu trắng ODAT: OD chứng âm tính
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo cơng thức của Ducal như sau: 2 i (x x) n 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (IC50) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 ( g / ml )
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị IC50 được xác định bằng chương trình table curve thơng qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50 % các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa chất thử.
- Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza
Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC Adenine dextrose citrate), pha loãng 10 – 20 lần bằng nước cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5 – 1 ml. Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh –80 oC. Khi dùng pha loãng thêm 25–50 lần bằng RB. H O (0,2N hay 2%).
Indigo: chuẩn bị dung dịch stock – 80oC: 0,1N, pha loãng 100 lần sẽ thu được dung dịch phản ứng 0,001N.
Chất thử:
+ Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ.
+ Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm.
Phản ứng:
+ 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1N + 10l chất thử pha trong DMSO và RB
+ 60 l enzym pha loãng 500 lần + 60 l H2O2 0,2N hay 2%
+ 20 l Indigocarmin 0,001N + 50 l TCA 20%
+ Giếng điều khiển âm khơng có enzym, khơng có chất thử, giếng điều khiển dương enzym hoạt động 100%, khơng có chất thử.
+ Để thời gian phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 – 25phút, dừng phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở bước sóng 610 nm.
Trong khn khổ đề tài này, chúng tôi thực hiện thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết và các chất sạch từ những cây nghiên cứu tại Phịng Hóa sinh ứng dụng-Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
* Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng nồng độ Hadacek F. Greger H. –2000. Chất đối chứng : Ampixilin đối với vi
+ Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D. A. và cộng sự trên 4 dòng tế bào KB; Hep.G2; LU, và MCF–7.
+ Hoạt tính kháng oxi hóa được thử theo phương pháp DPPH của Shela G. và cộng sự.
2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ
- Tế bào ung thư và ni cấy
Tất cả các dịng tế bào ung thư người được cung cấp bởi giáo sư JM Pezzuto, Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, Milan, Italy. Các dòng tế bào ung thư đơn lớp gồm: ung thư gan (Hep-G2), ung thư miệng (KB), ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF-7), ung thư hắc tố (SK-MeI2), ung thư bạch cầu cấp tính (HL60) , ung thư buồng trứng (SW626) và ung thư ruột kết (SW480) được nuôi cấy trong môi trường Dulbeco's Eagle cải tiến (DMEM) với 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM natri pyruvate và 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) (Gibco) . Các tế bào được cấy 3-5 ngày với tỷ lệ 1: 3 và ủ ở 37oC trong bầu khơng khí ẩm có 5% CO2.
- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào
Các hợp chất thử nghiệm được đánh giá hoạt tính trên dịng tế bào HL60 theo phương pháp MTT và trên bảy dòng tế bào khác còn lại theo phương pháp của Monk và cộng sự. Khả năng gây độc tế bào được đánh giá bằng cách xác định qua định lượng chất sulforhodamine B (SRB) liên kết với protein và thực hiện trong đĩa giếng vi lượng. Các mẫu thử nghiệm được kiểm tra với một khoảng nồng độ 0, 8- 100 g/ml. DMSO 10% được sử dụng làm đối chứng âm. Ellipticine (Sigma) làm đối chứng dương với nồng độ 10, 2, 0,4 và 0,08 g/ml. Dịch nuôi cấy tế bào được đưa lên đĩa giếng vi lượng (Costar, USA) có chứa 20 L của mỗi mẫu thử nghiệm và 180 L môi trường (10% FBS) ở mỗi giếng với mật độ 6000 tế bào/giếng. Thời gian thử nghiệm là 3 ngày. Đĩa giếng được ủ trong mơi trường khơng khí ẩm có 5% CO2, 37oC trong 72 h, trong khi giếng đối chứng ngày 0 (ngày bắt đầu) được ủ trong 1 h. Sau khi ủ, các tế bào được cố định trong 30 phút trên chất mang là nền nhựa bằng cách cho thêm 100 L dung dịch axit tricloaxetic (TCA) lạnh 20% trong
SRB (w/v) hòa tan trong 1% acid acetic. Các chất màu đã gắn vào tế bào được hòa tan khi cho thêm 10 mmol Tris base (Sigma) không chứa chất đệm. Độ hấp thụ được đo ở 515 nm với một đầu đọc vi giếng (BioRad). Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện ba lần và lấy giá trị trung bình.
*Hoạt tính gây độc tế bào.
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng sự. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia (NCI) Maryland, Hoa kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở