CHƢƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Chất 28 (TNV48A): cephalotaxine
Chất 28 phân lập từ dịch chiết alkaloid tổng dưới dạng dầu, màu vàng nâu. Phổ hồng ngoại của chất 28 (Hình 3.5) có đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm – OH ở 3309 cm-1, nhóm carbonyl (1649 cm-1), vùng tín hiệu 2939 cm-1, 2818 cm-1 là dao động hóa trị của nhóm CH2 và CH3.
Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu của 18 carbon, trong đó có 6 carbon bậc bốn, 5 carbon bậc ba, 6 carbon bậc hai và 1 nhóm carbon bậc một. Phổ 13C-NMR cũng cho tín hiệu methoxy ở vị trí = 57,2 ppm và 1 tín hiệu của nhóm methylene glycol -O–CH2-O- ở = 100,9 ppm.
Phổ 1H-NMR cho thấy hai tín hiệu singlet của vòng thơm tại H=6,67 ppm (1H, s, H-14); 6,64 ppm (1H, s, H-17) và 1 nhóm -OCH3 gắn với carbon bậc bốn với tín hiệu singlet tại: H = 3,71 ppm (3H, s, H-19). Ở vùng trường thấp cho tín hiệu của nhóm methylene glycol -O-CH2-O- với tín hiệu hai proton singlet tại: H = 5,89 ppm (2H, s, H-18).
Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z = 315,08 phù hợp với công
thức phân tử là C18H21NO4
Kết hợp các dữ kiện phổ của chất 28 với dữ liệu phổ cephalotaxine đã được công
bố, xác định cấu trúc của chất 28 là cephalotaxine (Bảng 3.2).
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR,13C-NMR củ a chất 28 và cephalotaxine
C Chất 28 Cephalotaxine [5] CDCl3 δC δH δC δH 1 97,6 4,92 (1H, s) 97,6 4,89 (1H, s) 2 160,5 160,5 3 73,3 4,75 (1H, d, J = 9,0 Hz) 73,2 4,70 (1H, d, J = 9,0 Hz) 4 58,0 3,67 (1H, d, J = 9,5 Hz) 57,1 3,63 (1H, d, J = 9,5 Hz) 5 70,6 70,5 6 43,5 1,85 (1H, m, H-6b) 2,01 (1H, m, H-6a) 43,6 7 20,3 1,74 (2H, m, H-7) 20,3 8 53,8 3,05 (1H, m, H-8a) 2,58 (1H, m, H-8b) 53,8 10 48,5 2,92 (2H, m, H-10) 48,5 11 31,6 2,35(1H, dd, J = 6,5; 14,5 Hz, H-11a) 3,34 (1H, m, H-11b) 31,7 12 134,2 134,3
13 128,0 128,0 14 112,6 6, 67 (1H, s). 112,6 6,65 (1H, s) 15 146,9 146,8 16 146,1 146,0 17 110,3 6,64 (1H, s) 110,2 6,61 (1H, s) 18 100,9 5,89 (2H, s ) 100,8 5,86 (2H, s) 19 57,2 3,71 (3H, d, J = 7,0 Hz ) 58,1 3,70 (3H, J = 7,0 Hz) Hình 3.5. Phổ IR của chất 28 (cephalotaxine)
Hình 3.6. Phổ giãn 1
H- NMR của chất 28 (cephalotaxine)
Hình 3.8. Phổ DEPT của chất 28 (cephalotaxine) 3.4. Chất 29 (TNV4): desoxyharringtonine
Chất 29 phân lập từ dịch chiết alkaloid tổng dưới dạng dầu, màu vàng nâu. Phổ hồng ngoại của chất 29 (Hình 3.9) có đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxyl (3396 cm-1), nhóm carbonyl (1742 cm-1), vịng thơm (1468 cm-1
). Phổ khối ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 515,95 [M+H]+
Phổ 1H-NMR (Hình 3.10) xuất hiện các tín hiệu tương tự so với chất cephalotaxine (28). Ngồi ra cịn xuất hiện thêm tín hiệu của 2 nhóm methyl dưới dạng doublet ở H = 0,83 (3H, d, H-4’’) và 0,84 (3H, d, H-5”); một tín hiệu singlet
của nhóm methoxyester ở H = 3,57 (3H, s, H-5’); 3 tín hiệu của nhóm methylene CH2 ở H = 0,98 (1H, m, H-2”a); 1,28 (1H, s, H-2’’b); 1,41 (2H, m, H-1”); 1,87(1H, s, H-3’a); 2,26 (1H, s, H-3’b).
Phổ 13C-NMR và DEPT (Hình 3.11) của chất 29 cho tín hiệu của 28 cacbon trong, bao gồm 2 nhóm methyl, 2 nhóm OCH3, 9 nhóm methylen, 6 nhóm methin và 9 carbon bậc 4. So sánh với phổ 13C-NMR của cephalotaxine (28), thấy xuất hiện thêm 2 nhóm carbonyl tại C = 170,4 (C-4’); 174,1 (C-1’) và 1 tín hiệu của nhóm carbon bậc ba liên kết với nhóm hydroxyl tại C = 74,6 ppm (C-2’).
Từ các số liệu của phổ MS, 1H-NMR và 13C-NMR, so sánh số liệu phổ desoxyharringtonine ghi trong cùng dung môi [5] [9] cho thấy chúng hoàn tồn giống nhau. Như vậy có thể kết luận rằng chất 29 chính là desoxyharringtonine.
Hình 3.10. Phổ 1
H-NMR của chất 29 (desoxyharringtonine)
3.5. Chất 30 (DTV1): nordesoxyharringtonine
Chất 30 phân lập từ dịch chiết alkaloid tổng dưới dạng dầu, màu vàng nâu. Phổ 1H-NMR (Hình 3.14) xuất hiện đầy đủ các tín hiệu của chất desoxyharringtonine. Chất 30 có 2 nhóm metyl dưới dạng tín hiệu doublet ở H = 0,81 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-3’’) và 0,84 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-4”), 1 tín hiệu singlet của nhóm methoxy ester ở H = 3,55 (3H, s, H-5’); các tín hiệu của 2 nhóm CH2 ở
H = 1,34 (2H, m, H-1’’); 1,81(1H, d, J = 15 Hz, H-3’a) và 2,22 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-3’b); 1 tín hiệu của nhóm methin H = 1,63-173 (1H, m, 2”).
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất 30 (Hình 3.15) khá giống với phổ chất 29. Tuy nhiên trên phổ chỉ xuất hiện 27 carbon, bao gồm 2 nhóm methyl, 2 nhóm OCH3, 2 carbonyl tại C = 170,3 (C-4’); 174,3 (C-1’); 6 nhóm methin và 9 carbon bậc 4; và chỉ có 7 nhóm methylen.
Kết hợp với phổ khối ESI-MS (Hình 3.13) m/z 502,4 [M+H]+ có thể khẳng định so với chất 29, chất 30 mất đi một methylene CH2. So sánh dữ liệu phổ chất 30 với nordesoxyharringtonine đã công bố (Bảng 3.3) [9] khẳng định được chất 30
Bảng 3.3: Số liệu phổ 13 C-NMR củ a chất 29, 30 và desoxy harringtonine, nordesoxy harringtonine C Chất 29 Chất 30 Desoxyharringtonine Nordesoxyharringtonine δC δC δC δC 1 100,07 99,9 99,9 100 2 157,8 157,7 157,9 157,8 3 74,7 74,7 74,5 74,8 4 55,9 55,8 55,8 55,9 5 70,6 70,5 70,7 70,6 6 43,4 43,2 43,3 43,4 7 20,3 20,1 20,2 20,3 8 53,9 53,8 53,9 54,0 10 48,6 48,4 48,5 48,7 11 31,3 31,2 31,2 31,3 12 133,3 133,2 133,1 133,4 13 128,4 128,3 128,3 128,4 14 112,6 112,5 112,6 112,7 15 146,6 146,5 146,6 146,7 16 145,8 145,7 145,8 145,8 17 109,7 109,6 109,6 109,7 18 100,8 100,6 100,8 100,8 19 57,1 56,9 57,1 57,1 1’ 174,0 174,2 174,0 174,4
2’ 74,6 75,1 74,7 75,2 3’ 42,7 43,2 42,7 43,4 4’ 170,4 170,3 170,4 170,5 5’ 51,4 51,3 51,4 51,5 1” 36,7 46,6 36,7 46,7 2” 31,6 23,9 31,5 23,9 3” 28,0 24,0 27,9 24,1 4” 22,2 24,0 22,2 24,1 5” 22,6 22,6 Hình 3.12. Phổ IR của chất 30 (nordesoxyharringtonine)
Hình 3.13. Phổ ESI-MS của chất 30 (nordesoxyharringtonine)
Hình 3.15. Phổ DEPT của chất 30 (nordesoxyharringtonine) 3.6. Hoạt tính sinh học của cây đỉnh tùng
3.6.1. Hoạt tính chống oxy hóa của chất 30 (DTV1)
Thử hoạt tính chống oxi hóa của chất 30 theo phương pháp đánh giá khả
năng quét gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Kết quả cho thấy hợp chất nordesoxyharringtonine (DTV1) có hoạt tính chống oxi hóa, nhưng khơng mạnh với giá trị IC50= 0,02 M (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của chất 30
Chất Kí hiệu mẫu Nồng độ chất thử trung hòa 50%
gốc tự do DPPH, IC50 (M)
30 DTV1
(Nordesoxyharringtonin)
0,02
Chất
tham khảo Quercetin 0,31
3.6.2. Hoạt tính gây độc tế bào
Hep-G2 (ung thư gan, IC50= 0,08), Lu (ung thư phổi, IC50= 0,01) và MCF (ung thư
vú, IC50= 0,01 μg/ml) với chất so sánh là ellipticin theo phương pháp MTT. Kết quả cho thấy chất 30 có hoạt tính mạnh gấp 5-10 lần so với chất tham khảo ellipticin
trên bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Các kết quả này gợi ý khả năng nghiên cứu tiếp theo đối với các dòng ung thư khác.
Bảng 3.5. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của chất DTV1
Chất Kí hiệu
mẫu Giá trị IC50
trên các dòng tế bào (nM)
KB Hep-G2 Lu MCF 7
30 DTV1 0,59 0,016 0,2 0,2
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Từ dịch chiết methanol của vỏ cây Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook.f) bước đầu đã phân lập được 5 chất sạch là epicatechin (26), harringtonolide (27), cephalotaxine (28), desoxyharringtonine (29) và nordesoxyharringtonine (30). Trong đó chất cephalotaxine và desoxyharringtonine có hàm lượng cao chiếm 0,24% so với mẫu khô.
Cấu trúc của các chất trên đã được xác định bằng việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phân giải cao (HR-ESI- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR, 13C-NMR.
Hợp chất nordesoxyharringtonine (30) có hoạt tính ức chế sự phát triển của bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm là KB (ung thư biểu mô) với IC50= 0,59 nM; Hep-G2 (ung thư gan) IC50= 0,016 nM ; Lu (ung thư phổi) IC50= 0,2 nM và MCF (ung thư vú) IC50= 0,2 nM. Đặc biệt chất này có hoạt tính mạnh hơn chất tham khảo là ellipticin từ 5-10 lần ở bốn dòng ung thư thử nghiệm theo phương pháp này.
Kết quả của đề tài đã đăng 1 bài báo trên Tạp chí Hóa học 2016.
2. Kiến nghị.
Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của các chất trong các phân đoạn còn lại của dịch chiết. Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết và các chất tách được.
Chất cephalotaxine và desoxyharringtonine có hàm lượng khá cao (0,24%), do đó có thể dùng làm nguyên liệu đầu để bán tổng hợp các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học cao, góp phần làm tăng giá trị sử dụng cũng như chữa bệnh của cây đỉnh tùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, NXB trẻ, trang 228. 2. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 479.
3. Đinh Gia Thiện (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học hai
loài Sơn Trà (Eriobotrya) và một loài cau chuột (Pinanga blume) của Việt Nam,
Luận án tiến sĩ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
4. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
5. D. Weisleder, R. G. Powell, Jr C.R. Smith (1980), “Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Cephalotaxus Alkaloids”, Org. Magn. Reson., 13,
pp.115-115.
6. Heng Xue, Chunhua Lu. Langing Liang and Yuemo Shen (2012), “Secondary Metabolites of Aspergillus sp. CM9a, an Endophytic Fungus of Cephalotaxus mannii”, Rec. Nat. Prod, 6(1), pp. 28-34.
7. Heng Xue, Qingyan Xu, Chunhua Lu, Yuemao Shen (2014), “Isotrypto- quivaline F, a new quinazolinone derivative with anti-TNF-α activity from Aspergillus sp. CM9a”, Drug Discoveries & Therapeutics,85(5), pp. 208-211. 8. I. Takano, I. Yasuda, M. Nishifima, Y. Hitotsuyanagi, K. Takeya, H. Itokawa (1996), Phytochemistry, 43, pp. 299-303.
9. I. Takano, I. Yasuda, M. Nishifima, Y. Hitotsuyanagi, K. Takeya, H. Itokawa (1996), J. Nat. Prod, 59, pp. 965-967.
10. Ichiro Takano, Ichiro Yasuda, Motohiro Nishijima, Yukio Hitotsuyanagi, Koichi Takeya and Hideji Itokawa (1996), “Cephalotaxidine, a Novel Dimeric Alkaloid from Cephalotaxus harringtonia var. drupacea”, Tetrahedron Letters, 37
11. Ichiro Takano, Ichiro Yasuda, Motohiro Nishijima, Yukio Hitotsuyanagi, Koichi Takeya and Hideji Itokawa (1996), “Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia”, Phytochemistry, 43 (1), pp. 299 –303.
12. Ichiro Takano, Ichiro Yasuda, Motohiro Nishijima, Yukio Hitotsuyanagi, Koichi Takeya and Hideji Itokawa (1997), “Ester-type Cephalotaxus Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia var. drupacea”, Phytochemistry, 44 (4), pp. 735 –
738.
13. J. George Buta, Judith L. Flippen, William R. Lusby (1978), “Harringtonolide, a Plant Growth Inhibitory Tropone from Cephalotaxusharringtonia (Forbes) K.
Koch”, J. Org. Chem, 43(5), pp. 1002-1003.
14. K. L. Mikolajczak, R. G. Powell and C. R. Smith, Jr. (1972), “Deoxyharringtonine, a new antitumor alkaloid from Cephalotaxus: Structure and
Synthetic studies”, Tetrahedron, 28, pp. 1995 –2001.
15. L. Evanno, A. Jossang, J. Nguyen-Pouplin, D. Delaroche, P. Herson, M. Seuleiman, B. Bodo, B. Nay (2008), “Further studies of the norditerpene (+)- harringtonolide isolated from Cephalotaxus harringtonia var. drupacea: Absolute
configuration, cytotoxic and antifungal activities”, Planta Med., 74, pp. 870-872. 16. M. Boca, A. Jossang, B. Bodo (2003), J. Nat. Prod., 66, pp. 152-154.
17. N. Langlois, B. C. Potier, P. Das (1970), Bull. Soc. Chim. Fr., 10, pp. 3535- 3543.
18. P. Potier et all. (1989), Tetrahedron, 45, pp. 4177 – 4190.
19. Raphaele Marder – Karsenti et all. (1997), “Synthesis and Biological Evaluation of D-Ring – Modified Taxanes”, 5 (20) – Azadocetaxel Analogs, J. Org.
Chem., 62 (19), pp. 6631 – 6637.
20. Richard G. Powell, Roger W. Miller, and Cecil R. Smith, Jr. (1979), “Cephalomannine; a New Antitumor Alkaloid fromCephalotaxus mannii”, The Journal of The Chemical Society.
21. R. G. Powell, R. W. Miller, C. R. Smith(1979), Jr. J.C.S. Chem. Comm., pp.
102-104.
23. R. G. Powell, D. Weisleder, and C. R. Smith, Jr. (1972), “Antitumor Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia: Structure an Activity”, The Journal of Pharmaceutical Sciences, 61 (8).
24. R. G. Powell, K. L. Micolajczak, D. Weisleder, and C. R. Smith, Jr. (1972), “Alkaloids of Cephalotaxus Wilsoniana”, Phytochemistry, 11, pp. 3317 – 3320. 25. Takano, I. Yasuda, M. Nishifima, Y. Hitotsuyanagi, K. Takeya, H. Itokawa (1996), Phytochemistry, 43, pp. 299-303.
26. W. W. Paudler, G. I. Kerley, J. B. Mc Kay (1963), “The Alkaloids of
Cephalotaxus drupacea and Cephalotaxus fortune”, J.Org. Chem., 28, page 2194.
27. Wojciech Cisowskia, Irena Mazola and Michal Glensk (2005), “Investigation of the essential oils from three Cephalotaxus species”, Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Research, 62 (6), pp. 461 – 463.
28. X. Lu, G. Chen, H. Hua, H. Dai, W. Mei, Y. Xu, Y. Pei (2012), Fitoterapia, 83, page 737.
29. Yong-Cheng Li (2014), “Enhanced cephalotaxine production in Cephalotaxus mannii suspension cultures by combining glycometabolic regulation and elicitation”, Process Biochemistry, 49 (12), pp. 2279-2284.
30. Yong-Cheng Li, Xuan-Xian Jiang, Xiao-Juan Long (2014), “Effects and action mechanisms of sodium fluoride (NaF) on the growth and cephalotaxine production
of Cephalotaxus mannii suspension cells”, Enzyme and Microbial Technology, 67,
pp. 77-81.
31. Yun Wei, Qianqian Xie, Wanting Donga, Yoichiro Ito (2009), “Separation of epigallocatechin and flavonoids from Hyperium perforatum L. by high-speed counter-current chromatography and preparative high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 1216, pp. 4313-4318.
32. Yao-Haur KUO,Shy-Yuan HWANG,Li-Ming YANG KUO,Yi-Ling LEE,Shyh- Yuan LI, and Ya-Ching SHEN (2002) “A Novel Cytotoxic C-Methylated Biflavone, Taiwanhomoflavone-B from the Twigs of Cephalotaxus wilsoniana”
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 – Phụ lục 3: Phổ của chất 26 (DTV Et2): epicatechin Phụ lục 4 – Phụ lục 11: Phổ của chất 27 (TNV1): harringtonolide Phụ lục 12 – Phụ lục 19: Phổ của chất 28 (TNV48A): cephalotaxine Phụ lục 20 – Phụ lục 30: Phổ của chất 29 (TNV4): desoxyharringtonine
Phụ lục 31 – Phụ lục 40: Phổ của chất 30 (TNV=DTV1): nordesoxyharringtonine Phụ lục 41: Bài báo đăng trên Tạp chí Hóa học .