CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.3 Sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC) hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng. Trong đó pha động là chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ là pha tĩnh như silicagel hoặc aluminium oxit (nhôm oxit), chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, và đều được phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhơm, hoặc tấm plastic. Loại sắc ký lớp mỏng này có thể dùng trong cả phân tích định tính và phân tích định lượng. Trong q trình di chuyển pha động kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp mẫu di chuyển với các tốc độ khác nhau phụ thuộc vào độ phân cực của chúng. Trong nghiên cứu này, bản sắc kí silica gel làm pha tĩnh được phủ trên bản nhôm. Pha động là hỗn hợp hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỉ lệ 96:4. Sắc kí đồ được thể hiện màu bằng phương pháp nhuộm xông hơi iôt [29].
2.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra q trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó.
Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách. Chúng tơi dựa vào thời gian lưu này để định tính được chất đó thơng qua mẫu chuẩn. Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất. Thơng thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích [27].
Trong đó:
H - chiều cao pic sắc ký của chất S - diện tích pic sắc ký của chất
k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký
b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1
2.4.5 Phương pháp điều chế mangostin phytosome
Điều chế phytosome mangostin dựa trên phương pháp bốc hơi dung môi theo nghiên cứu của các nhóm tác giả [11,13].
Cân 1 lượng khối lượng magostin và 1 lượng tương ứng phosphatidylcholin với tỉ lệ 1:1. Hòa tan α-mangostin sạch trong 80 ml methanol khuấy nhẹ trên máy gia nhiệt ở nhiệt độ 50o
C, phosphatidylcholine cũng được hòa vào 80 ml diclomethan khuấy nhẹ trên máy gia nhiệt. Trộn hai dung dịch trên vào bình cầu rồi đun cách thủy hồi lưu trong các thời gian 3h và ở nhiệt độ 400C, tốc độ quay khuấy từ 150 vịng/phút. Sau đó cơ quay dung dịch (loại hết dung mơi) đến hỗn hợp đậm đặc, tủa sản phẩm bằng việc bổ sung 50 ml n-hexan vào bình cơ quay rồi đem ly tâm thu cặn. Rửa sản phẩm bằng n-hexan lạnh (2 lần), để khô ở nhiệt độ phòng. Sản phấm thu được sấy ở 4000C trong 2 giờ, thu được mangostin phytosome, bảo quản ở 40
Hình 2.2 Sơ đồ bào chế mangostin phytosome
2.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid 2.4.5.1 Phương pháp đo quang phổ hồng ngoại IR 2.4.5.1 Phương pháp đo quang phổ hồng ngoại IR
Nguyên tắc: trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần số đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại. Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên kết. Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó.
Mục đích: Sau khi qt phổ và giải được phổ IR của phytosome, phân tích sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất.
2.4.5.2 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS
Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Bước sóng được sử dụng từ 200 đến 800 nm. Hiện tượng bức xạ điện từ tuân theo định luật Lamber-Beer
Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tạo phức mầu của các ion với thuốc thử. Nồng độ của các ion trong phức thay đổi sẽ tạo ra màu khác nhau, dẫn đến độ hấp thụ quang khác nhau. Độ hấp thụ quang được xác định theo phương trình :
A = Ɛ.l.C Trong đó:
Ɛ: Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào bản chất màu và bước sóng của ánh sáng tới. l: Chiều dày cu vet.
C: Nồng độ chất phân tích.
Khi l và Ɛ không đổi, độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ. Vì vậy, khi xây dựng được đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ C trong từng trường hợp cụ thể sẽ dễ dàng xác định được nồng độ chưa biết của một chất thông qua độ hấp thụ quang. Giới hạn phát hiện của phương pháp cỡ 10-5
M – 10-6M.
Sau khi đo UV-VIS của phytosome, phân tích sự thay đổi của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất.
2.4.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Nguyên lý: Phương pháp khuếch tán quá giếng thạch được sử dụng để xác
định hoạt tính kháng khuẩn, cụ thể phương pháp dựa trên khả năng đối kháng của hoạt chất đối với vi khuẩn cần ức chế. Những hoạt chất này cho vào trong các giếng đã đục trên môi trường đã trải sẵn vi khuẩn cần ức chế. Sau khi để hoạt chất khuếch tán đều trong giếng, đĩa này sẽ được nuôi trong tủ ấm sau khoảng một ngày. Đường kính vịng vơ khuẩn xung quanh giếng thể hiện khả năng kháng vi khuẩn của hoạt chất. Đường kính này càng lớn chứng tỏ khả năng ức chế của hoạt chất đối với vi sinh vật càng mạnh và ngược lại.
Tiến hành: Vi khuẩn S. aureus nuôi trong môi trường LB lỏng sau 24 giờ sau đó được trải đều trên đĩa thạch LB, mỗi lần trải cho 150 µl dịch ni. Sau đó đục giếng thạch, có một giếng đối chứng âm là methanol - chất để hòa tan α-mangostin và mangostin phytosome, các giếng còn lại là các tỉ lệ của hoạt chất α-mangostin và
phytosome mangostin lần lượt là 200 µg, 400 µg. Các đĩa sau khi cho chất thử hoạt tính kháng khuẩn vào trong các giếng, sẽ được để trong tủ lạnh 2 giờ nhằm khuếch tán đều hoạt chất trong giếng. Rồi được nuôi trong tủ ấm 37oC sau 24 giờ đem ra quan sát vịng vơ khuẩn. Đối với chủng nấm C.albicans 150 µl dịch ni cấy được trải đều lên đĩa petri. Khi ráo mặt thạch, sử dụng que đục để đục lỗ thạch, bổ sung 100 µl hoạt chất α-mangostin và mangostin phytosome đã được hòa tan với methanol ở các nồng độ khác nhau vào các giếng để hàm lượng đạt được trong các giếng lần lượt là 200 µg, 400 µg. Đối chứng sử dụng là 100 µl methanol, riêng với chủng S. aureus đối chứng dương sử dụng là 100 µl chloramphenicol 0,2%. Tiếp đó, để đĩa thử hoạt tính này vào tủ lạnh khoảng 2 giờ để cho hoạt chất được khuếch tán sau đó chuyển sang tủ 37ºC, ủ sau 24 giờ, quan sát vịng vơ khuẩn quanh giếng.
2.4.8 Xác định hoạt độ peroxidase
Nguyên lý: Hoạt độ peroxidase được xác định bằng phương pháp sử dụng
3,3-5,5-tetramethyl benzidine (TMB) làm cơ chất theo phương pháp của Josephy và cộng sự [26]. Trong mơi trường đệm phản ứng thích hợp có hydrogen peroxide (H2O2) và cơ chất TMB, H2O2 sẽ được khử thành H2O và oxy hóa cơ chất TMB tạo thành hợp chất có màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 492 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn có thể suy ra được hoạt độ peroxidase có trong mẫu cần phân tích (Hình 2.3).
Tiến hành: Thành phần phản ứng xác định hoạt độ peroxidase: 40 µl 0,6% TMB; 250 µl đệm 100 mM natri acetate pH 5,5; 50 µl dung dịch enzyme (50 µl nước cất cho đối chứng); 2 ml nước cất; 10 µl dung dịch 0,5% H2O2. Hỗn hợp phản
ứng được giữ ở 25C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng 100 µl dung dịch 2 N
H2SO4. Đo mật độ quang ở bước sóng 492 nm. Hoạt độ peroxidase được biểu thị
Hình 2.3. Đường chuẩn peroxidase có sử dụng chuẩn peroxidase horce
(Sigma)
2.4.9 Xác định làm lượng malondialdehyde
Nguyên lý: Hàm lượng MDA được định lượng theo Ohkawa và cộng sự (1979) [31]. MDA là một trong những sản phẩm thứ cấp trong q trình peroxy hóa lipid được gây ra bởi các gốc tự do. Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp, chất này sẽ phản ứng với TBA (thiobarbituric acid) tạo ra hợp chất trimethine có màu hồng hấp phụ cực đại ở bước sóng 532-535 nm. Đo độ hấp thụ của phức, suy ra hàm lượng MDA có trong mẫu. Nếu lượng MDA giảm so với mẫu đối chứng, mẫu được xác định là có hoạt độ chống oxy hóa.
Thành phần phản ứng xác định hàm lượng MDA: 300 l dung dịch 8,1% SDS; 300 µl đệm 20% sodium acetate pH 3,5; 300 µl dung dịch 0,8% TBA; 80 µl dung dịch enzyme. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng 1 giờ ở 95C, sau đó làm lạnh. Dùng hỗn hợp dung môi n-butanol : pyridine tỷ lệ 15:1 để chiết, lấy dịch trong màu hồng đo ở bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA được biểu thị bằng đơn vị đo g/g tổ chức với hệ số tắt là = 1,56 x 105
mol-1 x cm-1.
2.4.10 Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [19]. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bị (Hình 2.4).
y = 0.0174x - 0.0059 R2 = 0.99 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 2 4 6 8 10 12 14 Nồng độ BSA chuẩn O D (5 9 5 nm )
Hình 2.4. Đường chuẩn Bradford sử dụng BSA làm chuẩn
2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự do Nguyên lý phản ứng:
5.5’-dithio-bis (2nitrobenzoicacid) + R-SH Thiophenolatanion (màu vàng) Đo độ hấp thụ màu ở 420nm. Sử dụng hệ số ε420nm = 13.000 mM-1 cm-1 tính nồng độ mmol -SH/mg protein.
Các bước tiến hành:
- Cho dung dịch NaCl 9‰ và đệm phosphat pH: 8,0; 0,2M - Chia đều mẫu làm 2 ống, ống thử thêm dung dịch Ellmanm - Đo ở bước sóng 420 nm - Cách tính: D A mmol/ml SH C DTNB
Trong đó: A: mật độ quang học; D: hệ số pha loãng và ε : hệ số hấp thụ, ở 420nm là 13.000 mM-1cm-1. Kết quả tính ra mmol -SH/mg protein ở dịch cần đo.
2.4.12 Xử lý số liệu
Phần mềm Microsoft excel được sử dụng để xử lý số lượng thu được trong q trình thực nghiệm và tính các giá trị của các tham số thống kê, biểu thị bằng các biểu đồ thích hợp.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin 3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin
Áp dụng quy trình tinh sạch với các điều kiện tối ưu để thu được hiệu suất tách chiết hoạt chất α-mangostin như nhiệt độ là 60oC, thời gian là 4 giờ, dung môi là ethanol với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 3:1 từ các nghiên cứu trước [10]. Chúng tôi tiến hành tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt
Garcinia mangostana L.. Kết quả trên hình 3.1 cho thấy, đã thu nhận được cao
chiết chứa hoạt chất α-mangostin thô từ vỏ quả măng cụt.
A B C
Hình 3.1. Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin
(A); cất cơ quay loại dung mơi; (B) bình chiết có chứa cao chiết α-mangostin Sau khi cất cơ quay ở 40°C; (C) TLC mẫu cao chiết vỏ quả măng cụt có chứa hoạt chất α-mangostin sau khi tách chiết theo các thông số đã tối ưu
(C: -mangostin chuẩn; M1-M2 là các mẫu tách chiết lặp lại 2 lần thu nhận hoạt chất -mangostin).
Dịch chiết ethanol được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp phân tách phân đoạn. Cao chiết ethanol thu được chiếm đến 18,8% khối lượng nguyên liệu ban đầu (Bảng 3.1).
Dịch chiết được sử dụng để tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel hai lần. Sau khi tinh sạch bằng cột silicagel lần 1, các phân đoạn có chứa α-mangostin ở lần tinh sạch lần một được gộp lại và đưa lên cột tinh sạch lần hai với hệ dung môi là n- hexan : ethyl acetate tỷ lệ 6:1 và 12:1. Các phân đoạn sau đó được kiểm tra với sắc kí bản mỏng TLC.
LC 1 2 3 4 C 5 6 7 8 9 10
Hình 3.2. Ảnh chạy sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh sạch α-mangostin
qua cột silica gel lần thứ hai với hệ dung môi chloroform: acetone tỷ lệ 5:1 ( C: α-mangostin chuẩn; LC: mẫu lên cột; 1-10: Các phân đoạn tinh sạch α-mangostin
sau khi lên cột silicagel lần 2)
Kết quả hình 3.2 cho thấy các phân đoạn từ 1-10 xuất hiện duy nhất một băng ngang chuẩn với α-mangostin (Chromadex) có Rf = 0,7 cm trong hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỷ lệ 96:4 và không xuất hiện băng phụ, điều này chứng tỏ sau khi qua cột silica gel lần hai, chúng tôi đã thu được α-mangostin sạch. Kết quả này cao hơn so với nghiên cứu của Misra và cộng sự (2009) khi sử dụng hệ dung mơi chloroform : methanol với 9:1 có Rf = 0,46 cm [36]. Sự chênh lệch giữa hai giá trị Rf trên có thể là do sự khác nhau của các hệ dung môi được chọn làm pha động khi TLC. Bảng 3.1 cho thấy lượng -mangostin thu được sau khi tinh sạch chiếm 0,142% khối lượng nguyên liệu ban đầu. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự (2008), công bố tách chiết được lượng mangostin bao
gồm các hoạt chất -mangostin, -mangostin, -mangostin chiếm 9,94% khối lượng nguyên liệu [50]. Tuy nhiên, lượng -mangostin thu được ở nghiên cứu này cao hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả Iinuma và cộng sự tách chiết được lượng - mangostin chiếm 0,0019% khối lượng nguyên liệu thơ [25]. Ngun nhân có thể do hiệu suất thu hồi trong q trình sắc kí cột silica gel khơng ổn định, và ngun liệu có nguồn gốc khác nhau thì hàm lượng -mangostin cũng khác nhau.
Bảng 3.1. Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô. Sản phẩm So với nguyên liệu thô (%) Sản phẩm So với nguyên liệu thô (%)
Cao chiết ethanol 18,875 ± 0,5210
Cao chiết n- hexan 0, 174 ± 0,0457
- mangostin tinh sạch 0,142 ± 0,0419
Hoạt chất - mangostin tinh sạch được xác định cấu trúc bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân. Từ các phổ 1H-NMR, 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC (khơng dẫn hình); so sánh dữ liệu phổ của hoạt chất - mangostin với các tài liệu trên thế giới và các đặc trưng vật lí, hợp chất trên được xác định đúng là -mangostin như các tài liệu đã công bố. Công thức cấu tạo của - mangostin như sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 8a 9a 4a 10a 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1' O HO H3CO O OH OH 11 A B
Hình 3.3. Hoạt chất α-mangostin dạng tinh thể
(A) và công thức cấu tạo của hoạt chất α-mangostin (1,3,6-trihydroxy-7-methoxy- 2,8-bis(3-methylbut-2-enyl)xanthen-9-one)
Độ sạch của -mangostin cũng được kiểm tra bằng phương pháp HPLC. Kết quả thu được cho thấy mẫu -mangostin chỉ còn một đỉnh duy nhất với thời gian lưu là 19,968 chiếm tới 98,58% tổng khối lượng chất lên cột. Điều này chứng tỏ, hoạt chất thu được đã tinh sạch (Hình 3.4, Bảng 3.2). Như vậy, sản phẩm thu được đủ độ sạch và độ tin cậy cao có thể sử dụng làm nguyên liệu tạo hoạt chất mangostin phytosome.
Hình 3.4 Phổ HPLC của hoạt chất - mangostin sau khi qua các