Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid

CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid

2.4.5.1 Phương pháp đo quang phổ hồng ngoại IR

Nguyên tắc: trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần số đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại. Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên kết. Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó.

Mục đích: Sau khi quét phổ và giải được phổ IR của phytosome, phân tích sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất.

2.4.5.2 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Bước sóng được sử dụng từ 200 đến 800 nm. Hiện tượng bức xạ điện từ tuân theo định luật Lamber-Beer

Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tạo phức mầu của các ion với thuốc thử. Nồng độ của các ion trong phức thay đổi sẽ tạo ra màu khác nhau, dẫn đến độ hấp thụ quang khác nhau. Độ hấp thụ quang được xác định theo phương trình :

A = Ɛ.l.C Trong đó:

Ɛ: Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào bản chất màu và bước sóng của ánh sáng tới. l: Chiều dày cu vet.

C: Nồng độ chất phân tích.

Khi l và Ɛ khơng đổi, độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ. Vì vậy, khi xây dựng được đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ C trong từng trường hợp cụ thể sẽ dễ dàng xác định được nồng độ chưa biết của một chất thông qua độ hấp thụ quang. Giới hạn phát hiện của phương pháp cỡ 10-5

M – 10-6M.

Sau khi đo UV-VIS của phytosome, phân tích sự thay đổi của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất.

2.4.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Nguyên lý: Phương pháp khuếch tán quá giếng thạch được sử dụng để xác

định hoạt tính kháng khuẩn, cụ thể phương pháp dựa trên khả năng đối kháng của hoạt chất đối với vi khuẩn cần ức chế. Những hoạt chất này cho vào trong các giếng đã đục trên môi trường đã trải sẵn vi khuẩn cần ức chế. Sau khi để hoạt chất khuếch tán đều trong giếng, đĩa này sẽ được nuôi trong tủ ấm sau khoảng một ngày. Đường kính vịng vơ khuẩn xung quanh giếng thể hiện khả năng kháng vi khuẩn của hoạt chất. Đường kính này càng lớn chứng tỏ khả năng ức chế của hoạt chất đối với vi sinh vật càng mạnh và ngược lại.

Tiến hành: Vi khuẩn S. aureus nuôi trong môi trường LB lỏng sau 24 giờ sau đó được trải đều trên đĩa thạch LB, mỗi lần trải cho 150 µl dịch ni. Sau đó đục giếng thạch, có một giếng đối chứng âm là methanol - chất để hòa tan α-mangostin và mangostin phytosome, các giếng còn lại là các tỉ lệ của hoạt chất α-mangostin và

phytosome mangostin lần lượt là 200 µg, 400 µg. Các đĩa sau khi cho chất thử hoạt tính kháng khuẩn vào trong các giếng, sẽ được để trong tủ lạnh 2 giờ nhằm khuếch tán đều hoạt chất trong giếng. Rồi được nuôi trong tủ ấm 37oC sau 24 giờ đem ra quan sát vịng vơ khuẩn. Đối với chủng nấm C.albicans 150 µl dịch ni cấy được trải đều lên đĩa petri. Khi ráo mặt thạch, sử dụng que đục để đục lỗ thạch, bổ sung 100 µl hoạt chất α-mangostin và mangostin phytosome đã được hòa tan với methanol ở các nồng độ khác nhau vào các giếng để hàm lượng đạt được trong các giếng lần lượt là 200 µg, 400 µg. Đối chứng sử dụng là 100 µl methanol, riêng với chủng S. aureus đối chứng dương sử dụng là 100 µl chloramphenicol 0,2%. Tiếp đó, để đĩa thử hoạt tính này vào tủ lạnh khoảng 2 giờ để cho hoạt chất được khuếch tán sau đó chuyển sang tủ 37ºC, ủ sau 24 giờ, quan sát vịng vơ khuẩn quanh giếng.

2.4.8 Xác định hoạt độ peroxidase

Nguyên lý: Hoạt độ peroxidase được xác định bằng phương pháp sử dụng

3,3-5,5-tetramethyl benzidine (TMB) làm cơ chất theo phương pháp của Josephy và cộng sự [26]. Trong mơi trường đệm phản ứng thích hợp có hydrogen peroxide (H2O2) và cơ chất TMB, H2O2 sẽ được khử thành H2O và oxy hóa cơ chất TMB tạo thành hợp chất có màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 492 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn có thể suy ra được hoạt độ peroxidase có trong mẫu cần phân tích (Hình 2.3).

Tiến hành: Thành phần phản ứng xác định hoạt độ peroxidase: 40 µl 0,6% TMB; 250 µl đệm 100 mM natri acetate pH 5,5; 50 µl dung dịch enzyme (50 µl nước cất cho đối chứng); 2 ml nước cất; 10 µl dung dịch 0,5% H2O2. Hỗn hợp phản

ứng được giữ ở 25C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng 100 µl dung dịch 2 N

H2SO4. Đo mật độ quang ở bước sóng 492 nm. Hoạt độ peroxidase được biểu thị

Hình 2.3. Đường chuẩn peroxidase có sử dụng chuẩn peroxidase horce

(Sigma)

2.4.9 Xác định làm lượng malondialdehyde

Nguyên lý: Hàm lượng MDA được định lượng theo Ohkawa và cộng sự (1979) [31]. MDA là một trong những sản phẩm thứ cấp trong q trình peroxy hóa lipid được gây ra bởi các gốc tự do. Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp, chất này sẽ phản ứng với TBA (thiobarbituric acid) tạo ra hợp chất trimethine có màu hồng hấp phụ cực đại ở bước sóng 532-535 nm. Đo độ hấp thụ của phức, suy ra hàm lượng MDA có trong mẫu. Nếu lượng MDA giảm so với mẫu đối chứng, mẫu được xác định là có hoạt độ chống oxy hóa.

Thành phần phản ứng xác định hàm lượng MDA: 300 l dung dịch 8,1% SDS; 300 µl đệm 20% sodium acetate pH 3,5; 300 µl dung dịch 0,8% TBA; 80 µl dung dịch enzyme. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng 1 giờ ở 95C, sau đó làm lạnh. Dùng hỗn hợp dung môi n-butanol : pyridine tỷ lệ 15:1 để chiết, lấy dịch trong màu hồng đo ở bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA được biểu thị bằng đơn vị đo g/g tổ chức với hệ số tắt là  = 1,56 x 105

mol-1 x cm-1.

2.4.10 Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [19]. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bị (Hình 2.4).

y = 0.0174x - 0.0059 R2 = 0.99 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 2 4 6 8 10 12 14 Nồng độ BSA chuẩn O D (5 9 5 nm )

Hình 2.4. Đường chuẩn Bradford sử dụng BSA làm chuẩn

2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự do Nguyên lý phản ứng:

5.5’-dithio-bis (2nitrobenzoicacid) + R-SH Thiophenolatanion (màu vàng) Đo độ hấp thụ màu ở 420nm. Sử dụng hệ số ε420nm = 13.000 mM-1 cm-1 tính nồng độ mmol -SH/mg protein.

Các bước tiến hành:

- Cho dung dịch NaCl 9‰ và đệm phosphat pH: 8,0; 0,2M - Chia đều mẫu làm 2 ống, ống thử thêm dung dịch Ellmanm - Đo ở bước sóng 420 nm - Cách tính: D A mmol/ml   SH C DTNB

Trong đó: A: mật độ quang học; D: hệ số pha loãng và ε : hệ số hấp thụ, ở 420nm là 13.000 mM-1cm-1. Kết quả tính ra mmol -SH/mg protein ở dịch cần đo.

2.4.12 Xử lý số liệu

Phần mềm Microsoft excel được sử dụng để xử lý số lượng thu được trong quá trình thực nghiệm và tính các giá trị của các tham số thống kê, biểu thị bằng các biểu đồ thích hợp.