CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy
tuyển chọn
2.6.1. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển
Để đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng vi khuẩn được tuyển chọn, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm gián tiếp số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa.
a. Nguyên tắc: Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi
trường thạch đặc trưng và sau đó đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ. Mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào.
b. Tiến hành:
- Dịch nuôi cấy được pha lỗng trong nước muối sinh lý vơ trùng (0,9%) ở nồng độ thích hợp.
- Lấy 100 μL mẫu đã pha lỗng nhỏ lên trên mơi trường thạch đã khử trùng ở 121oC, 15 phút, sau đó dàn đều bằng que gạt. Nuôi ở 30o
C trong 4-7 ngày. Đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
- Số lượng tế bào được xác định theo công thức sau:
Với: A: Số tế bào vi khuẩn trong 1 mL hay 1 g mẫu (CFU/mL hoặc CFU/g) N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni : Số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V : Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (mL) fi : Độ pha loãng tương tứng
2.6.2. Phương pháp đánh giá khả năng cố định N
Để đánh giá khả năng cố định N, chúng tôi sử dụng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler (mục 2.5).
2.6.3. Thời gian nuôi cấy
Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Ashby dịch thể ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian khác nhau: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ngày, tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.6.4. Nồng độ muối NaCl
Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Ashby dịch thể, bổ sung NaCl vào môi trường đến các nồng độ lần lượt: 0, 3, 6, 12, 18, 24, 30‰. Nuôi ở 30oC, sau thời gian ni cấy thích hợp, tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.6.5. pH môi trường
Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Ashby dịch thể, với các giá trị pH lần lượt: 5; 5,5; 6; 6,5; 7. Ni ở 30oC, sau thời gian ni cấy thích hợp, tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.6.6. Nguồn N
Chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường Ashby dịch thể, bổ sung các nguồn cơ chất N: cao nấm men, casein, peptone, NH4Cl, (NH4)6Mo7O24.4H2O, (NH4)2SO4, Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O, NaNO3, KNO3 với nồng độ 0,5 g/L. Ni ở 30oC, sau thời gian ni cấy thích hợp, tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn nghiên cứu.