1. Một số tính chất đất vùng RNM ở Thừa Thiên Huế
Tiến hành phân tích một số chỉ tiêu lý, hóa học của các mẫu đất ở một số vùng đất ngập mặn ở Thừa Thiên Huế. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.
1.1 Chỉ số pHKCl
Trong đất pH là một yếu tố độ phì quan trọng, nó ảnh hưởng đến tính chất hóa, lý và sinh hóa, khả năng di động của chất dinh dưỡng, khả năng hút thu của bộ rễ cũng như mối quan hệ giữa các nguyên tố dinh dưỡng trong đất. Đa số cây trồng thích hợp ở pH trung tính 6 – 7. pH của đất là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật và cây trồng. Theo kết quả phân tích đất nghiên cứu có pH hơi kiềm do đây là đất rừng ngập mặn.
1.2 Chất hữu cơ
Trong quá trình hoạt động của mình các vi sinh vật, thực vật, động vật và con người đã làm cho hàm lượng mùn trong đất được tích lũy dần theo thời gian qua q trình hình thành đất.
Có thể nói rằng hàm lượng mùn quyết định hình thái, tính chất lý, hóa học của đất cũng như độ phì của đất, có tác dụng cải tạo các tính chất đất của cây trồng đồng thời nó cịn là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, song các chất dinh dưỡng này ở dạng dự trữ để sử dụng được nó phải qua q trình khống hóa chuyển các hợp chất này từ dạng hữu cơ sang dạng vơ cơ khi đó
cây trồng mới sử dụng được. Mùn trong đất được coi là kho dự trữ dinh dưỡng cho cây trồng.
Theo thang đánh giá, đất nghiên cứu có hàm lượng chất hữu cơ là 1,911%; 2,224% và 1,56% , đất có hàm lượng chất hữu cơ trung bình, nhưng đối với đất của RNM thì hàm lượng chất hữu cơ của Rú Chá ở mức nghèo. Điều này phù hợp với báo cáo tổng kết nghiên cứu RNM Rú Chá, Hương Phong, Thừa Thiên – Huế tháng 6/2010 của chi cục kiểm lâm tỉnh Thừa Thiên Huế (hàm lượng mùn của đất RNM Rú Chá tương đối nghèo, trung bình đạt 3,69%)
1.3 Thành phần cơ giới
Thành phần cơ giới là hàm lượng phần trăm của những nguyên tố cơ học có kích thước khác nhau khi đoàn lạp đất ở trong trạng thái bị phá hủy.
Thành phần cơ giới có vai trị quan trọng quyết định một số tính chất lý, hóa quan trọng của đất như: độ chặt, cấu trúc đất, độ giữ ẩm và khả năng hấp phụ và trao đổi ion, khả năng hút thu và dự trữ chất dinh dưỡng của đất.
Kết quả phân tích mẫu đất cho thấy đất nghiên cứu là loại đất thịt pha sét và pha cát.
1.4 Hàm lượng N tổng số và dễ tiêu
Hàm lượng N tổng số trong các mẫu đất vùng ngập mặn tương đối thấp: 0,196% (mẫu ở Rú Chá), 0,1715% (mẫu Cồn Tè) và 0,077% (mẫu Thuận An). Điều này là do đất có hàm lượng cát cao nên khả năng giữ chất dinh dưỡng của đất yếu, N trong đất rất dễ bị xảy ra quá trình phản nitrate, đất ngập mặn thường xuyên nên chất dinh dưỡng rất dễ bị rửa trơi. Ngồi ra, hàm lượng N dễ tiêu ở trong các mẫu Rú Chá, Cồn Tè và Thuận An cũng thấp tương ứng là 15,4; 14,84 và 10,976 mg/100 g đất. Từ kết quả phân tích hàm lượng N trong mẫu đất nền và nhu cầu N của thực vật ngập mặn, ta thấy lượng N dễ tiêu sẵn có trong đất khơng thể đáp ứng nhu cầu N của thực vật, thực vật ngập mặn tại khu vực đang thiếu dinh dưỡng N, điều này ảnh hưởng rất lớn tới sinh trưởng, phát triển của thực vật.
1.5 Hàm lượng P tổng số và dễ tiêu
Hàm lượng P tổng số trong các mẫu đất nền nghiên cứu ở mức trung bình với 2 mẫu Rú Chá (0,961%) và mẫu Thuận An (0,868%), riêng mẫu đất ở Cồn Tè lại giàu P (1,5552%). Tuy nhiên hàm lượng P dễ tiêu trong đất lại rất thấp (hàm lượng P dễ tiêu ở trong các mẫu Rú Chá, Cồn Tè và Thuận An tương ứng là 0,36; 0,984 và 0,589 mg/100 g đất). Nguyên nhân có thể là do P trong đất chủ yếu tồn tại ở dạng hợp chất không tan nên mặc dù hàm lượng P tổng số cao nhưng hàm lượng P dễ tiêu lại rất thấp. Điều này giải thích tại sao đất rất giàu P mà cây trồng vẫn thiếu P.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định N từ đất vùng RNM tại Thừa Thiên Huế RNM tại Thừa Thiên Huế
2.1 Tìm hiểu sự phân bố vi khuẩn cố định N ở vùng rễ cây ngập mặn
Tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N từ mẫu đất ở RNM Rú Chá (Hương Trà) và Cảnh Dương (Phú Lộc), Thừa Thiên Huế trên môi trường Ashby thạch đĩa, kết quả xác định số lượng của vi khuẩn cố định N ở vùng rễ một số cây ngập mặn được trình bày ở bảng 5.
Kết quả ở bảng 5 cho thấy, số lượng vi khuẩn phân bố tại các khu vực nghiên cứu có sự phân bố khơng đồng đều, số lượng lớn nhất là mẫu đất khu vực xung quanh cây Đước (Cảnh Dương) có 18,90 x 106 CFU/g đất khơ, và số lượng ít nhất là mẫu đất xung quanh cây ráng (Rú Chá) chỉ có 1,53 x 106 CFU/g đất khơ. Khu vực có tổng số lượng vi khuẩn nhiều nhất là RNM ở Cảnh
Dương, điều này có thể do RNM ở Cảnh Dương là một hệ sinh thái có từ rất lâu, hệ vi sinh vật đất ở đây do đó cũng đa dạng hơn về số lượng và loài.
Theo kết quả của Phạm Thị Ngọc Lan và Võ Thị Mai Hương (2004), khi nghiên cứu vi khuẩn cố định N sống tự do trong đất trồng màu ở Thừa Thiên Huế, mặc dù có sự biến động khá lớn nhưng số lượng vi khuẩn trong các mẫu đất nghiên cứu lại rất cao. Thấp nhất là mẫu đất ở Phú Bình (Huế), số lượng vi khuẩn là 55,1 x 106 CFU/g đất khô, cao nhất là ở mẫu đất Hương Hồ - Hương Trà, số lượng vi khuẩn lên tới 281,5x106CFU/g đất khơ.
Từ những so sánh trên có thể thấy rằng, sự đa dạng về thành phần loài vi khuẩn cố định N phụ thuộc rất nhiều vào nguồn gốc phân lập. Đối với RNM, lớp trầm tích nói chung được đặc trưng bởi mơi trường nước lợ, thường có hàm lượng carbon hữu cơ cao nhưng lại bị hạn chế về N và P. Ngoài một phần N được đem tới từ đất liền, nguồn N chính để đảm bảo cân bằng trong chu trình tuần hồn vật chất ở RNM do nhóm vi khuẩn cố định N đảm nhiệm. Vì vậy, vai trị của vi khuẩn cố định N hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của hệ thực vật RNM.
2.2 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N
Dựa trên sự khác biệt về hình thái của các khuẩn lạc phát triển trên mơi trường phân lập, sơ bộ tuyển chọn 60 chủng vi khuẩn từ các mẫu đất nghiên cứu, ký hiệu là N1, N2, N3,…, N60. Khi quan sát các khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên môi trường phân lập, chúng tơi nhận thấy có các đặc điểm chung: đa số khuẩn lạc có màu trắng, từ trắng trong tới trắng đục, dạng trịn, mép đều hoặc khơng đều, bề mặt lồi, nhầy nhớt, đường kính khoảng 2 - 4 mm. Một số khuẩn lạc có đường kính 5 - 7 mm. Chỉ một số ít khuẩn lạc có màu vàng lục, vàng nhạt, cam, dạng vơ định hình, bề mặt hơi dẹt, trơn bóng. Các khuẩn lạc đều không tiết sắc tố ra môi trường.
Các chủng vi khuẩn được cấy chuyền qua ống thạch nghiêng và bảo quản ở nhiệt độ 4oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 5. Phân lập vi khuẩn trên môi trường Ashby thạch đĩa
Theo nghiên cứu của Liu J. và cộng sự (2012), khi tiến hành phân lập vi khuẩn cố định N từ các mẫu đất vùng rễ cây ngập mặn tại Khu bảo tồn thiên nhiên Quốc gia RNM Dongzhaigang (Trung Quốc) đã thu được 135 chủng thuộc 9 loài, lớn hơn nhiều so với kết quả phân lập của chúng tôi [34]. Điều này có thể là do sự khác biệt về thành phần cơ giới đất, đặc điểm lý hóa của đất như pH, độ mặn, độ chua, hệ thực vật, điều kiện nhiệt độ, ánh sáng… của khu bảo tồn này so với RNM tại Thừa Thiên Huế.
Tuy nhiên, Dhara P. Sachdev và cộng sự (2009), chỉ phân lập được 9 chủng vi khuẩn cố định N từ đất vùng rễ cây lúa mì [23]. Theo Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (1999) khi nghiên cứu vi khuẩn Azotobacter trên đất vùng gò đồi tỉnh Thừa Thiên Huế đã phân lập được 37 chủng từ 03 mẫu đất vùng rễ keo tai tượng, tràm hoa vàng và đất đối chứng [10].
2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt lực cố định N cao 2.3.1 Sơ tuyển các chủng vi khuẩn cố định N 2.3.1 Sơ tuyển các chủng vi khuẩn cố định N
Để đánh giá khả năng cố định N, 60 chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường Ashby thạch nghiêng. Sau 4 - 7 ngày, tiến hành sơ tuyển loại bỏ các chủng mọc yếu, giữ lại 40 chủng. Tiếp tục nuôi cấy 40 chủng trên để tuyển chọn các chủng có khả năng cố định N mạnh nhất, kết quả được trình bày ở bảng 6.
Từ bảng 6 chúng tôi nhận thấy: trong số 40 chủng, có 16 chủng vi khuẩn cố định N mức trung bình, chiếm tỷ lệ lớn nhất (40,0%), các chủng vi khuẩn có khả năng cố định N yếu cũng chiếm tỷ lệ khá lớn (32,5%), trong khi số chủng vi khuẩn có năng lực cố định N rất mạnh chỉ có 2 chủng, chiếm tỷ lệ thấp nhất (5%).
Theo Đỗ Kim Nhung và Vũ Thành Công (2011), trong số 16 chủng vi khuẩn cố định N phân lập từ đất trồng mía, chỉ có 2 chủng vi khuẩn có khả năng cố định N mạnh (chiếm tỷ lệ 12,5%) [15]. Trong số 137 chủng vi khuẩn cố định N phân lập từ đất vùng gò đồi tỉnh Thừa Thiên Huế, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự tuyển chọn được 6 chủng có khả năng cố định N mạnh (chiếm tỷ lệ 4,4%) [10].
Như vậy có thể thấy rằng, tuy sự phân bố của vi khuẩn cố định N từ các khu vực mà chúng tôi nghiên cứu không đều nhau, số lượng chủng phân lập được ít, nhưng tỷ lệ vi khuẩn có khả năng cố định N mạnh thông qua sơ tuyển cũng chiếm một tỷ lệ tương đương với nghiên cứu của các tác giả khác tại các khu vực đất nơng nghiệp hoặc lâm nghiệp, có điều kiện dinh dưỡng khơng q khắc nghiệt như ở RNM. Sau khi sơ tuyển, chúng tôi giữ lại 05 chủng vi khuẩn có năng lực cố định N cao nhất cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt lực cố định N cao
Tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định N mạnh nhất trong số 05 chủng đã sơ tuyển, kết quả được trình bày ở bảng 7.
Kết quả ở bảng 7 cho thấy, trong số 05 chủng vi khuẩn sơ tuyển, chủng N27 có khả năng cố định N mạnh nhất với hàm lượng N-NH4+ đạt 3,44 mg/L, chủng N32 cũng có khả năng cố định N cao, với hàm lượng N-NH4+ đạt 3,02 mg/L.
Theo Đỗ Kim Nhung và Vũ Thành Công (2011), trong s ố 16 chủng vi khuẩn cố định N phân lập từ đất trồng mía, chủng A1 có khả năng cố định N với hàm lượng 8,09 mg/L sau 4 ngày nuôi cấy [15]. Tuy nhiên, Đỗ Hồnh Qn (2011) khi nghiên cứu đặc tính cố định đạm của vi khuẩn Azotobacter từ các mẫu đất lấy ở các địa điểm khác nhau (Hà Nội, Lâm Đồng, Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Bến Tre), hàm lượng N-NH4+ cố định được của chủng Az 07 trong điều kiện nuôi cấy tối ưu lên tới 164,27 mg/L [16].
Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá rằng khả năng cố định N của các chủng vi khuẩn phân lập từ RNM yếu hơn so với chủng vi khuẩn phân lập từ các nguồn khác. Điều này có thể do điều kiện sinh trưởng, phát triển ở RNM có phần khắc nghiệt hơn và có tính biến động cao do đây là vùng chuyển tiếp giữa đất liền và biển. Nhưng cũng có thể do thời gian nghiên cứu chưa nhiều, tần số phân lập chưa đủ lớn để phát hiện được sự đa dạng của nhóm vi khuẩn này ở vùng RNM.
Từ kết quả trên, chúng tơi chọn chủng N27 có khả năng cố định N cao nhất trong số 05 chủng sơ tuyển làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo. Chủng N27 được phân lập từ mẫu đất vùng rễ cây sú, ở khu vực RNM Cảnh Dương với hình thái khuẩn lạc được thể hiện ở hình 6.
Hình 6. Hình thái khuẩn lạc của chủng N27 trên môi trường Ashby thạch đĩa 2.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng N27
2.4.1 Thời gian nuôi cấy
Xác định thời gian tối ưu cho khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn N27, kết quả được trình bày ở bảng 8, hình 7 và 8.
Qua hình 7 và 8, ta thấy khả năng tổng hợp N-NH4+và mật độ tế bào của chủng N27 có biến động tăng theo thời gian và đạt cực đại sau 5 ngày nuôi cấy với mật độ tế bào đạt 19,18 x 106CFU/mL và hàm lượng N-NH4+ đạt 3,79 mg/L, sau đó giảm dần. Điều này có thể là do lượng chất dinh dưỡng trong môi trường không đủ đáp ứng hoặc do tích lũy dần các sản phẩm trao đổi chất có ảnh hưởng bất lợi, chủng vi khuẩn dần sử dụng nguồn N cố định được, các tế bào cũng chuyển dần sang pha tử vong. Đồng thời khả năng trao đổi chất nói chung cũng như hoạt động cố định N nói riêng ở chủng vi khuẩn này sẽ giảm mạnh.
Theo Nguyễn Kim Anh và cộng sự (2008), thời gian nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng và khả năng cố định N của chủng vi khuẩn BK-6 thuộc giống
Azotobacter phân lập từ đất tại Phường Hòa Quý, quận Ngũ Hành Sơn, thành
phố Đà Nẵng là 5 ngày [2]. Trong khi đó, Đỗ Kim Nhung và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng cố định của 12 dòng vi khuẩn Azospirillium sp. cho thấy thời gian tối ưu là sau 4 ngày nuôi cấy [15]. Như vậy, thời gian nuôi cấy tối ưu cho khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chủng vi sinh vật, môi trường và điều kiện nuôi cấy. Trong trường hợp này, thời gian nuôi cấy chủng N27 tối ưu là 5 ngày.
2.4.2 pH môi trường
Xác định pH môi trường tối ưu cho khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng vi khuẩn N27, kết quả được trình bày ở bảng 9, hình 9 và 10.
Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 9, hình 9 và 10 cho thấy: ở các giá trị pH khác nhau thì khả năng sinh trưởng, phát triển và cố định N của chủng N27 có sự khác nhau. Khi pH môi trường tăng dần từ 5,0 đến 6,5 thì các chỉ tiêu về mật độ tế bào và hàm lượng N-NH4+ cũng tăng dần và đạt cực đại tại giá trị pH 6,5 (mật độ tế bào 19,02 x 106 CFU/mL, hàm lượng N-NH4+ tổng hợp được là 7,463 mg/L). Ở các giá trị pH cao hơn, từ 7,0 đến 8,0 thì khả năng sinh trưởng cũng như cố định N của chủng N27 giảm dần, tuy nhiên mức độ giảm khơng q lớn. Như vậy có thể thấy rằng chủng N27 có sự thích nghi đối với pH acid yếu và trung tính.
Theo Đỗ Hồng Qn (2011) khoảng pH mơi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và hoạt tính cố định N của 02 chủng vi khuẩn Az 03 và Az 07 thuộc chi Azotobacter phân lập từ đất canh tác là 7,0 - 7,5 [16]. Bên cạnh
đó, Gül Fidan Saribay (2003) đã chỉ ra điều kiện sinh trưởng, phát triển và cố định N đạt cực đại của vi khuẩn Azotobacter chroococcum ở giá trị pH 8,0
(1,50 mg/L) và giảm xuống còn 1,07 mg/L ở pH 7,0 [31]. Trong trường hợp nghiên cứu của chúng tôi, giá trị pH tối ưu cho hoạt động sinh trưởng và hoạt tính cố định N của chủng N27 là pH = 6,5.